如今，質(zhì)粒載體中限制酶切位點(diǎn)的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點(diǎn)恰恰與外源ＤＮＡ片段本身毫無(wú)二致的載體。這就具備一個(gè)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如，識(shí)別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開(kāi)。然而很多清況下，用切點(diǎn)位于多克隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化，可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，不可能找到“門當(dāng)戶對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決：
１）在線狀質(zhì)粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
２）在得到控制的反應(yīng)條件下，用大腸桿菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補(bǔ)平帶3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所討論，這樣常可以使那些不相匹配的限制酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端，從而促進(jìn)載體和外源ＤＮＡ的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力，故連接反應(yīng)過(guò)程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低（Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986）。