此處介紹蔬菜中維生素K1的測定方法（HPLC法）和食物及飼料中水溶性維生素K3（甲萘醌）的測定方法
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經有機溶劑提取后，經失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
（1） 實驗室常用設備
（2） 打碎機
（3） 202-R型恒溫干燥箱
（4） 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
（5） 旋轉蒸發(fā)器
與旋轉蒸發(fā)器配套的旋轉蒸發(fā)瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
（6） 恒溫水浴鍋
（7） 高純氮氣
（8） 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
（9） 紫外分光光度計
（10） HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
（1） 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色�；蚣�4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
（2） 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：優(yōu)級純。
3.10 正己烷：優(yōu)級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
（1） 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體（包括懸浮的細小顆粒），然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結塊，冷卻后放入干燥器中保存。
（2） 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
（3） 驗證處理過的氧化鋁：取標準應用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉蒸發(fā)瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高（A）。另取標準應用液直接測定，記錄峰面積或峰高（Ar）。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間（A/Ar），則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應用液濃度。
所有操作均需避光進行
5.1 樣品處理
（1） 新鮮蔬菜：揀凈去雜物，將可食部洗凈，擦去表面水分，切碎，用打碎機制備成勻漿。
（2） 干制植物性樣品：磨碎,過60目篩。
5.2 樣品提取
（1） 稱取已打成勻漿的新鮮樣品2～10g（維生素K1含量不低于2μg），加到具塞錐形瓶中,再加入5～10倍體積的丙酮,蓋上塞子,振搖3～5min，靜置1min，以下按5.3步驟操作。
（2） 稱取干制植物性樣品0.2～4g（維生素K1含量不低于2μg）,加到研缽中，再加入2～4倍于樣品量的無水Na2SO4研磨均勻后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，靜置1min。
（注：對于細胞壁比較厚的樣品，如藻類食品，可先用石英砂研磨，破壞植物組織細胞。石英砂需進行預處理，將石英砂用20目篩子過篩之后，先用濃鹽酸浸泡，然后再用稀氫氧化銨浸泡，最后用蒸餾水洗至中性后在烘箱中烤干。使用時，每10g樣品加3～5g石英砂于研缽中研磨。）
5.3 洗滌
將上部澄清液倒入已裝有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，殘渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。殘渣繼續(xù)用石油醚洗滌3～4次，每次用量約25ml，至洗滌液呈無色，將洗滌液倒入同一分液漏斗中，振搖1min，靜置。棄水相，有機相用蒸餾水洗滌4～5遍，至水相澄清。棄水相，將有機相經無水Na2SO4脫水后轉至旋轉蒸發(fā)瓶中，于60℃水浴中減壓蒸餾至約2ml時取下，立即用氮氣吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待凈化。
5.4 裝柱
取干燥色譜柱，將驗證好的氧化鋁浸泡于石油醚中，濕法填充于色譜柱，使氧化鋁自由均勻流下，至柱高為20cm，其上端再加2 cm無水Na2SO4。打開活塞，調整流速為每秒1滴。一根色譜柱只用于一個樣品測定。
5.5 色譜凈化：待石油醚流至柱上端0.5cm時，加V1 ml樣品提取液，當樣品液流至柱平齊時，加2 ml石油醚沖洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脫，2次，棄除流出液。然后，用30 ml洗脫液洗脫，用旋轉蒸發(fā)瓶收集流出液。流出液于旋轉蒸發(fā)器濃縮近干，取下用氮氣吹干后，用正己烷定容為V2 ml。將定容液移入小塑料離心管中，5000rpm離心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 標準工作曲線的繪制
分別取維生素K1標準應用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步驟提取，濃縮定容至2.0ml。取1.0ml標準提取液按5.4步驟操作，最后定容至1.0ml，即標準工作曲線中各點維生素K1含量分別相當于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6條件進行HPLC測定，記錄峰面積或峰高。以標準含量為橫坐標，峰面積或峰高為縱坐標繪制標準工作曲線。
5.7 HPLC色譜分析
色譜條件（推薦條件）：
預柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流動相：甲醇+正己烷（98+2）�；靹颍R用前脫氣。
進樣量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外檢測器：波長248nm。量程0.01～0.05。
HPLC穩(wěn)定性的測定：取標準應用液連續(xù)進行6次HPLC測定，計算峰面積或峰高的平均值、標準差和RSD%，如果RSD<1%，說明儀器穩(wěn)定性良好。儀器穩(wěn)定后方可進行樣品測定。
5.8 樣品分析
取樣品凈化液20μl，按色譜條件進行定性、定量分析。
�。�1） 定性：用標準色譜峰的保留時間定性。
�。�2） 定量：用樣品峰面積或峰高在標準工作曲線上查出其相應的維生素K1含量，或用回歸方程求出其含量。
6.計算
（1） 7.1允許差及最小檢出量: 同一實驗室同時或連續(xù)2次測定結果相對偏差絕對值≤10%，本法最小檢出限為0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化處理，減少了維生素K1的破壞；利用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁進行色譜分離，通過改變洗脫液的極性使維生素K1與雜質分離，有利于高效液相色譜對維生素K1的定性及定量分析。
（3） 維生素K1具有很強的親脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、異辛烷等溶劑中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。當樣品中含有較多的水分時，如直接用石油醚或正己烷提取會使樣品變粘，因此，樣品需先用丙酮提取，或先用無水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，進一步地破壞樣品的細胞組織，使提取效果更佳。
（4） 以往的報告多選用活性硅膠或中性氧化鋁做色譜柱分離維生素K1，再用極性小的有機溶劑作洗脫液。實際工作中發(fā)現，用硅膠色譜柱，洗脫流速慢，洗脫液用量大，分離時間較長；用未經處理的氧化鋁色譜柱分離會出現維生素K1與干擾物分離不清的現象。當氧化鋁用磷酸鹽處理后，氧化鋁的極性增強，使吸附較小的維生素K1易于被洗脫液洗脫出來，而且在處理后的氧化鋁中加入少量水分可以提高柱效，減少維生素K1出峰拖尾的現象，縮短保留了時間，避免了因使用氧化鋁造成的維生素K1可能分解的現象。
（5） 如果氧化鋁色譜柱柱效良好，首先被石油醚洗脫出來的應是胡蘿卜素，且柱上沒有胡蘿卜素黃色帶擴散的現象；葉綠素及其他色素停留在色譜柱的上方沒有或僅有少量位移但不影響分離效果。
（6） 洗脫液中乙醚含量的多少影響著洗脫液的極性，如果乙醚含量少，可使維生素K1的保留時間延長，反之，會使干擾物質被提前洗脫，影響凈化效果。所以應嚴格控制洗脫液中乙醚的比例。
（7） 根據標準維生素K1紫外掃描圖譜，可見維生素K1于240，248nm，260，269nm波長處有4個特征峰，其中260nm的峰最低。將標準品用HPLC測定，以260nm波長下的峰面積為1，則240nm, 248nm和269nm波長下的峰面積分別為1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色譜，多用有極性的甲醇作為流動相。在甲醇中加入適量的非極性有機溶劑（如正己烷、異辛烷等），可以增加維生素K1 的溶解能力，有利于縮短保留時間，減少出峰拖尾現象。本方法選擇甲醇+正己烷（98+2）作為流動相，維生素K1的保留時間為15.6±0.1min。
（9） 本方法最小檢測限為0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范圍內與峰面積有良好的線形關系。批間測定結果的相對標準偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率為90.9～106.3%。。不同實驗室間測定結果表明此方法精密度、重現性較好，凈化效果好，試劑價格適中。
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經有機溶劑提取后，經失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
（1） 實驗室常用設備
（2） 打碎機
（3） 202-R型恒溫干燥箱
（4） 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
（5） 旋轉蒸發(fā)器
與旋轉蒸發(fā)器配套的旋轉蒸發(fā)瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
（6） 恒溫水浴鍋
（7） 高純氮氣
（8） 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
（9） 紫外分光光度計
（10） HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
（1） 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色�；蚣�4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
（2） 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：優(yōu)級純。
3.10 正己烷：優(yōu)級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
（1） 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體（包括懸浮的細小顆粒），然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結塊，冷卻后放入干燥器中保存。
（2） 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
（3） 驗證處理過的氧化鋁：取標準應用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉蒸發(fā)瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高（A）。另取標準應用液直接測定，記錄峰面積或峰高（Ar）。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間（A/Ar），則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應用液濃度。
|
X1 = |
A |
×M ×103 |
……………………………………(1) |
|
E |
式中：
X1 -- 維生素K1標準應用液濃度，μg/ml；
A -- 標準應用液平均紫外吸光值；
E -- 摩爾消光系數，20,000；
M -- 維生素K1分子量450.7；
103 -- 換算成μg/ml的換算系數。
A -- 標準應用液平均紫外吸光值；
E -- 摩爾消光系數，20,000；
M -- 維生素K1分子量450.7；
103 -- 換算成μg/ml的換算系數。
5.操作步驟
所有操作均需避光進行
5.1 樣品處理
（1） 新鮮蔬菜：揀凈去雜物，將可食部洗凈，擦去表面水分，切碎，用打碎機制備成勻漿。
（2） 干制植物性樣品：磨碎,過60目篩。
5.2 樣品提取
（1） 稱取已打成勻漿的新鮮樣品2～10g（維生素K1含量不低于2μg），加到具塞錐形瓶中,再加入5～10倍體積的丙酮,蓋上塞子,振搖3～5min，靜置1min，以下按5.3步驟操作。
（2） 稱取干制植物性樣品0.2～4g（維生素K1含量不低于2μg）,加到研缽中，再加入2～4倍于樣品量的無水Na2SO4研磨均勻后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，靜置1min。
（注：對于細胞壁比較厚的樣品，如藻類食品，可先用石英砂研磨，破壞植物組織細胞。石英砂需進行預處理，將石英砂用20目篩子過篩之后，先用濃鹽酸浸泡，然后再用稀氫氧化銨浸泡，最后用蒸餾水洗至中性后在烘箱中烤干。使用時，每10g樣品加3～5g石英砂于研缽中研磨。）
5.3 洗滌
將上部澄清液倒入已裝有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，殘渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。殘渣繼續(xù)用石油醚洗滌3～4次，每次用量約25ml，至洗滌液呈無色，將洗滌液倒入同一分液漏斗中，振搖1min，靜置。棄水相，有機相用蒸餾水洗滌4～5遍，至水相澄清。棄水相，將有機相經無水Na2SO4脫水后轉至旋轉蒸發(fā)瓶中，于60℃水浴中減壓蒸餾至約2ml時取下，立即用氮氣吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待凈化。
5.4 裝柱
取干燥色譜柱，將驗證好的氧化鋁浸泡于石油醚中，濕法填充于色譜柱，使氧化鋁自由均勻流下，至柱高為20cm，其上端再加2 cm無水Na2SO4。打開活塞，調整流速為每秒1滴。一根色譜柱只用于一個樣品測定。
5.5 色譜凈化：待石油醚流至柱上端0.5cm時，加V1 ml樣品提取液，當樣品液流至柱平齊時，加2 ml石油醚沖洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脫，2次，棄除流出液。然后，用30 ml洗脫液洗脫，用旋轉蒸發(fā)瓶收集流出液。流出液于旋轉蒸發(fā)器濃縮近干，取下用氮氣吹干后，用正己烷定容為V2 ml。將定容液移入小塑料離心管中，5000rpm離心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 標準工作曲線的繪制
分別取維生素K1標準應用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步驟提取，濃縮定容至2.0ml。取1.0ml標準提取液按5.4步驟操作，最后定容至1.0ml，即標準工作曲線中各點維生素K1含量分別相當于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6條件進行HPLC測定，記錄峰面積或峰高。以標準含量為橫坐標，峰面積或峰高為縱坐標繪制標準工作曲線。
5.7 HPLC色譜分析
色譜條件（推薦條件）：
預柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流動相：甲醇+正己烷（98+2）�；靹颍R用前脫氣。
進樣量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外檢測器：波長248nm。量程0.01～0.05。
HPLC穩(wěn)定性的測定：取標準應用液連續(xù)進行6次HPLC測定，計算峰面積或峰高的平均值、標準差和RSD%，如果RSD<1%，說明儀器穩(wěn)定性良好。儀器穩(wěn)定后方可進行樣品測定。
5.8 樣品分析
取樣品凈化液20μl，按色譜條件進行定性、定量分析。
�。�1） 定性：用標準色譜峰的保留時間定性。
�。�2） 定量：用樣品峰面積或峰高在標準工作曲線上查出其相應的維生素K1含量，或用回歸方程求出其含量。
6.計算
| X2= | c×2×V2 ×100 | ………………………（2） |
|
V1×m |
式中： X2 -- 樣品中維生素K1的含量,μg/100g;
c -- 由標準工作曲線上查出或回歸方程求出的維生素K1含量,μg;
2 -- 樣品提取后的定容體積,ml;
V1 -- 樣品凈化處理時的取液量,ml;
V2 -- 樣品凈化后的定容體積,ml;
m -- 樣品質量,g。
c -- 由標準工作曲線上查出或回歸方程求出的維生素K1含量,μg;
2 -- 樣品提取后的定容體積,ml;
V1 -- 樣品凈化處理時的取液量,ml;
V2 -- 樣品凈化后的定容體積,ml;
m -- 樣品質量,g。
7. 注意事項
（1） 7.1允許差及最小檢出量: 同一實驗室同時或連續(xù)2次測定結果相對偏差絕對值≤10%，本法最小檢出限為0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化處理，減少了維生素K1的破壞；利用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁進行色譜分離，通過改變洗脫液的極性使維生素K1與雜質分離，有利于高效液相色譜對維生素K1的定性及定量分析。
（3） 維生素K1具有很強的親脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、異辛烷等溶劑中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。當樣品中含有較多的水分時，如直接用石油醚或正己烷提取會使樣品變粘，因此，樣品需先用丙酮提取，或先用無水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，進一步地破壞樣品的細胞組織，使提取效果更佳。
（4） 以往的報告多選用活性硅膠或中性氧化鋁做色譜柱分離維生素K1，再用極性小的有機溶劑作洗脫液。實際工作中發(fā)現，用硅膠色譜柱，洗脫流速慢，洗脫液用量大，分離時間較長；用未經處理的氧化鋁色譜柱分離會出現維生素K1與干擾物分離不清的現象。當氧化鋁用磷酸鹽處理后，氧化鋁的極性增強，使吸附較小的維生素K1易于被洗脫液洗脫出來，而且在處理后的氧化鋁中加入少量水分可以提高柱效，減少維生素K1出峰拖尾的現象，縮短保留了時間，避免了因使用氧化鋁造成的維生素K1可能分解的現象。
（5） 如果氧化鋁色譜柱柱效良好，首先被石油醚洗脫出來的應是胡蘿卜素，且柱上沒有胡蘿卜素黃色帶擴散的現象；葉綠素及其他色素停留在色譜柱的上方沒有或僅有少量位移但不影響分離效果。
（6） 洗脫液中乙醚含量的多少影響著洗脫液的極性，如果乙醚含量少，可使維生素K1的保留時間延長，反之，會使干擾物質被提前洗脫，影響凈化效果。所以應嚴格控制洗脫液中乙醚的比例。
（7） 根據標準維生素K1紫外掃描圖譜，可見維生素K1于240，248nm，260，269nm波長處有4個特征峰，其中260nm的峰最低。將標準品用HPLC測定，以260nm波長下的峰面積為1，則240nm, 248nm和269nm波長下的峰面積分別為1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色譜，多用有極性的甲醇作為流動相。在甲醇中加入適量的非極性有機溶劑（如正己烷、異辛烷等），可以增加維生素K1 的溶解能力，有利于縮短保留時間，減少出峰拖尾現象。本方法選擇甲醇+正己烷（98+2）作為流動相，維生素K1的保留時間為15.6±0.1min。
（9） 本方法最小檢測限為0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范圍內與峰面積有良好的線形關系。批間測定結果的相對標準偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率為90.9～106.3%。。不同實驗室間測定結果表明此方法精密度、重現性較好，凈化效果好，試劑價格適中。