手機(jī)版
紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖
免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說(shuō)法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無(wú)法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)完美的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照�？傊�，免疫熒光實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />
基本實(shí)驗(yàn)步驟：
（1） 細(xì)胞準(zhǔn)備。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.
（5） 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
（6） 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測(cè)。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
（一）細(xì)胞準(zhǔn)備
用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接生長(zhǎng)在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞，也可以是經(jīng)過(guò)離心后涂片的懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時(shí)直接放入coverslips讓細(xì)胞生長(zhǎng)在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實(shí)驗(yàn)需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察，建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
（二）固定和通透
除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的目的有三：
①防止細(xì)胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂；
③使標(biāo)本易于保存。
標(biāo)本的固定原則是：
①不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；
②不能凝集蛋白質(zhì)；
③應(yīng)保持細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
④固定后應(yīng)保持通透性，以保證抗體自由進(jìn)入所有細(xì)胞與亞細(xì)胞組分與抗原結(jié)合。
常用的固定劑有多種，應(yīng)根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌�。通常固定方法可以分為兩類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過(guò)自由氨基酸基團(tuán)形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更易于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但因?yàn)榻宦?lián)阻礙抗體結(jié)合，可能會(huì)降低一些細(xì)胞組分的抗原性，因此需要增加一個(gè)通透步驟以使抗體能夠進(jìn)入標(biāo)本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進(jìn)行固定。通常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果，而細(xì)胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進(jìn)行通透以使抗體能達(dá)到抗原表位。
通透步驟只在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候才需要，因?yàn)榭贵w需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢測(cè)蛋白。但是，如果待檢測(cè)的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透。相反，如果所檢測(cè)的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進(jìn)行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時(shí)是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場(chǎng)合并不適合用甲醇，因?yàn)橐恍┍砦粚?duì)甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細(xì)胞核膜，因此非常適合核抗原檢測(cè)。但應(yīng)該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，它們將破壞蛋白，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過(guò)，但是不會(huì)溶解細(xì)胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但針對(duì)有些水不溶性的目的抗原的檢測(cè)宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過(guò)通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號(hào)。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。
（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。
（四）抗體孵育
直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時(shí)候必須注意避光。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥，抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進(jìn)行。
（五）封片及熒光觀察
標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片原則上可以直接進(jìn)行觀察，特別是有時(shí)候封片不當(dāng)反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結(jié)果，以便進(jìn)一步觀察、照像、統(tǒng)計(jì)分析等，需作封片處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹(shù)脂封片，為了增強(qiáng)封片的效果，往往需要在封片時(shí)添加特殊的抗熒光淬滅劑。
（六）標(biāo)本保存
由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對(duì)的，因此隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在各種條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標(biāo)本的 保存帶來(lái)一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現(xiàn)，熒光標(biāo)記的標(biāo)本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。在某些情形下，考慮到實(shí)驗(yàn)的成本及實(shí)驗(yàn)條件，也可以采取權(quán)宜的辦法，比如固定標(biāo)本片后低溫保存，在需要時(shí)再進(jìn)行熒光標(biāo)記，即隨用隨染。
