一、免疫膠體金技術(shù)的基本知識

1、膠體金的概念

氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。

2、免疫金標(biāo)記技術(shù)

膠體金顆粒表面負電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。膠體金對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面，無共價鍵形成，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。

3、膠體金的示蹤原理

金顆粒具有高電子密度的特性。金標(biāo)蛋白在相應(yīng)的配體處大量聚集時，在顯微鏡下可見黑褐色顆�；蛉庋劭梢娂t色或粉紅色斑點。

免疫金銀染色：利用金顆�？纱呋�銀離子還原成金屬銀這一原理，通過銀顆粒的沉積，在光鏡下可見抗原抗體反應(yīng)的陽性部位呈現(xiàn)銀的黑褐色。

二、膠體金的制備

1、膠體金制備的注意事項

（1）玻璃容器的清潔：玻璃容器應(yīng)絕對清潔，用前酸洗、硅化。

（2）試劑、水質(zhì)：實驗用水一般用雙蒸水。緩沖液有足夠大的緩沖容量，濃度不應(yīng)過高以免金溶膠自凝。

2、常用方法

一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、白磷。

（1）檸檬酸三鈉還原法：

取0.01％氯金酸水溶液100 ml加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入１％檸檬酸三鈉水溶液0.7 ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區(qū)最高吸收峰在535 nm，Ａ1 cm/535 nm=1.12。

100 ml氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響：

１％檸檬酸三鈉（ml ）0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00

金溶膠顏色                   藍灰 紫灰  紫紅 紅   橙紅  橙

吸收峰(nm)                    220   240    535   525   522   518

徑粒(nm)                        147   97.5   71.5   41   24.5   15

（2）檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：改變鞣酸的加入量，制得不同大小的膠體顆粒。

（3）白磷還原法：制備的膠體金直徑約6 nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實驗室不宜采用。

三、免疫膠體金的制備

1、制備膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)應(yīng)注意的問題

（1）蛋白質(zhì)的預(yù)處理。蛋白質(zhì)應(yīng)先對低離子強度的水透析，去除鹽類成分。用微孔濾膜或超速離心除去蛋白質(zhì)溶液中的細小微粒。

（2）低鹽濃度的緩沖液。過量鹽可使金顆粒發(fā)生凝集。

（3）PH接近于蛋白質(zhì)等電點或略偏堿性。蛋白質(zhì)所處溶解狀態(tài)最適合偶聯(lián)，蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。

（4）蛋白質(zhì)最適用量的選擇：能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加10％即為最佳標(biāo)記蛋白量。

（5）膠體金與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后，加入穩(wěn)定劑，以避免產(chǎn)生凝集。一般選用PEG（分子量為20000）和牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。

2、常見方法

（1）用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH。

（2）加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液，攪拌2～3分鐘。

（3）加入5 ml 1％PEG20000 溶液。

（4）于10000～100000 g離心，小心吸去上清液。

（5）將沉淀懸浮于一定的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以Ａ1 cm/540 nm=1.5左右為宜，置4 ℃保存。

 四、免疫膠體金的應(yīng)用

1、膠體金在光鏡水平、電鏡水平的應(yīng)用

直徑為3～15 nm膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。最大優(yōu)點是可以通過應(yīng)用不同大小的顆粒進行雙重或多重標(biāo)記。

膠體金用于光鏡水平、電鏡水平的研究，主要包括：①細胞懸液或單層培養(yǎng)中細胞表面抗原的觀察。②單層培養(yǎng)中細胞內(nèi)抗原的檢測。③組織切片中抗原的檢測。

2、膠體金在流式細胞儀中的應(yīng)用

應(yīng)用膠體金標(biāo)記的抗體，分析細胞表面抗原。膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，區(qū)分不同的標(biāo)記，能同時進行幾種標(biāo)記。

3、凝集試驗

單分散的免疫金溶膠清澈透明。與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒增大、沉降，光散射隨之發(fā)生變化，溶液的顏色發(fā)生變化。

4、免疫印跡技術(shù)

用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，與特異性的抗體保溫后，再與膠體金標(biāo)記物溫育，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。金免疫印跡技術(shù)有相當(dāng)高的靈敏度。采用免疫金銀染色法，靈敏度可低至0.1 ng。

5、膠體金在肉眼水平的應(yīng)用--膠體金免疫結(jié)合試驗

根據(jù)檢測裝置的不同可分為金免疫層析試驗和金免疫滲濾試驗。

1、金免疫層析試驗

（1）免疫層析條的組成，有4個組分：⑴吸水紙（加樣區(qū)）。⑵玻璃纖維膜，膜上吸附著干燥的金標(biāo)抗體（流動帶）。⑶硝酸纖維素膜，膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標(biāo)記物直接起反應(yīng)的質(zhì)控物條帶（檢測帶）。⑷吸水紙。以上各組分首尾互相銜接。

（2）免疫層析條制作中須注意的幾個問題

微孔濾膜：硝酸纖維素膜有2個特性：較高的蛋白吸附容量和良好的親水性，應(yīng)用最多。硝酸纖維素膜的活化：先使硝酸纖維素膜上形成氨基手臂，然后再加入戊二醛在手臂上形成自由醛基，多肽與活化膜的活性基團共價聯(lián)接。

受體：①與膜材料的結(jié)合穩(wěn)定。②有較高的生物活性，因而有足夠的配體捕獲容量。③有較高的純度，以保證檢測的特異性。④可流動性。標(biāo)記或非標(biāo)記受體以干態(tài)吸附于流動帶，在流動帶加入高效助溶劑，從而使受體具有快速溶解的特性。

（3）反應(yīng)模式有夾心法、間接法、競爭法

例1 金免疫層析法檢測嗎啡（競爭法）：

嗎啡是鴉片類鎮(zhèn)痛藥，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。是可待因和海洛因的主要代謝物質(zhì)，嗎啡不經(jīng)代謝即可排泄。

測定原理：嗎啡偶聯(lián)物和膠體金標(biāo)記的抗嗎啡單克隆抗體固定于膜上測試區(qū)。通過嗎啡偶聯(lián)物和尿液中的嗎啡競爭結(jié)合金標(biāo)單克隆抗體，最小檢出量300 ng/ml。

結(jié)果判定：

陽性（+）：嗎啡300 ng/ml以上，質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，測試區(qū)內(nèi)不出現(xiàn)紫紅色條帶。嗎啡濃度高于300 ng/ml時，膠體金抗體與嗎啡全部結(jié)合，從而不與嗎啡偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紫紅色條帶。陰性（-）：嗎啡在300ng/ml以下。出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，一條在測試區(qū)內(nèi)，另一條在質(zhì)控區(qū)內(nèi)。嗎啡濃度低于300ng/ml時，膠體金抗體不能與嗎啡全部結(jié)合。這樣，膠體金抗體在層析過程中會被固定在膜上的嗎啡偶聯(lián)物結(jié)合，測試區(qū)內(nèi)會出現(xiàn)一條紫紅色條帶。無效：質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。

質(zhì)控區(qū) 測試區(qū) 流動帶

二抗 嗎啡偶聯(lián)物 金標(biāo)單抗

例2 金層析免疫法測定甲胎蛋白（夾心法）：

甲胎蛋白（AFP）是原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)示物，對肝癌的早期診斷、早期治療具有重要臨床意義。AFP單抗A、B，羊抗鼠二抗固定于硝酸纖維素膜上，金標(biāo)AFP單抗C固定于玻璃纖維素膜上。陰性1條帶，陽性2條帶， 3條帶為強陽性，不出現(xiàn)有色條帶為試劑失效。

質(zhì)控帶 陽性 陽性 流動帶

羊抗鼠二抗 單抗A 單抗B 金標(biāo)單抗C

例3 金免疫層析法檢測梅毒抗體（間接法）：

膠體金標(biāo)記的抗人IgG，樣品中的梅毒抗體與膠體金標(biāo)記的抗人IgG結(jié)合，沿硝酸纖維素膜移動，在包被有基因重組的梅毒螺旋體抗原結(jié)合，出現(xiàn)紅色反應(yīng)線。

質(zhì)控帶 陽性 流動帶

抗原 金標(biāo)抗人IgG

2、金免疫滲濾分析

（1）試劑盒：滲濾裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒，在盒蓋中央的小孔下面放置了一片硝酸纖維素膜，膜上預(yù)包被抗原或抗體斑點。

（2）反應(yīng)模式：間接法、夾心法、捕獲法、競爭法。

間接法：抗原固定于膜上→標(biāo)本（抗體），洗滌→金標(biāo)二抗。

夾心法：抗體A固定于膜上→標(biāo)本（抗原）→金標(biāo)單抗B。

捕獲法：在固相載體上包被二抗→樣品（待測抗體）→抗原→金標(biāo)單抗。

競爭法：在載體上包被抗體→加入待測抗原→加入標(biāo)記抗原

3、金免疫層析分析和金免疫滲濾分析的比較

（1）相同點：檢測原理相同。以微孔濾膜為載體，濾膜的毛細管作用促進抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，通過膠體金結(jié)合物達到檢測目的。

（2）不同點：

硝酸纖維素膜的種類、形式及組成方式。金免疫層析分析為狹長形膜，由4部分組成，依次是吸水紙、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜、吸水紙。金免疫滲濾分析為圓形硝酸纖維素膜及底層的吸水墊料。

標(biāo)記配體的形式。金免疫層析分析為固相形式，金免疫滲濾分析為液相形式。

液體的移動方向。金免疫層析分析是通過層析作用的橫向流動，金免疫滲濾分析是通過垂直穿透固定有配體的硝酸纖維素膜而進行。

操作步驟。金免疫層析分析大多只有加樣一個步驟；金免疫滲濾分析有加樣、洗滌、加標(biāo)記配體等。

4、金免疫層析分析和金免疫滲濾分析特點

（1）單份測定，試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul。

（2）不需任何檢測儀器，適于現(xiàn)場應(yīng)用。

（3）沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與。

（4）實驗結(jié)果可以長期保存。

（5）檢測速度快，幾分鐘即可用肉眼觀察結(jié)果。

5、膠體金免疫結(jié)合試驗在臨床檢驗中的應(yīng)用

主要用于檢測正常體液中不存在的抗原性物質(zhì)、正常人含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)。

（1）激素。早早孕診斷試劑人絨毛膜促性腺激素，檢測尿液。

（2）傳染病病原的抗原和抗體。肝炎病毒、艾滋病病毒抗體等。

（3）性病病原：梅毒螺旋體抗體、淋球菌等。

（4）細菌：結(jié)核桿菌抗體、胃幽門螺桿菌抗體等。

（5）寄生蟲：弓形蟲抗體、血吸蟲抗體等。

（6）腫瘤標(biāo)記物：前列腺癌特異抗原（消化道惡性腫瘤尤其是結(jié)腸癌）、甲胎蛋白（肝癌）

（7）心血管病檢測標(biāo)志物：血清心肌肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶，診斷急性心肌梗塞。

（8）其他蛋白質(zhì)：甲狀腺微粒體抗體（橋本甲狀腺炎）

（9）其他：血糖、尿糖及尿液中嗎啡和海洛因等。

6、金免疫結(jié)合試驗的發(fā)展前景

（1）進一步提高檢測靈敏度。采用信號放大系統(tǒng)如生物素親和素系統(tǒng)或免疫金銀染色法，并結(jié)合一些相應(yīng)的簡單檢測儀器。

（2）實現(xiàn)檢測多元化。在同一膜上作多種項測定，檢測某些具有聯(lián)檢意義的物質(zhì)。

（3）實現(xiàn)定量或半定量檢測。

GIFA可用反射光密度計對斑點顏色的強度進行測定，可得到半定量的結(jié)果；控制受體捕獲量：固定多種不同量的受體，在膜上包被多條反應(yīng)線，觀察各自顯色情況，將待測物含量確定于某一濃度區(qū)間。

（4）通用試劑的應(yīng)用。

膠體金標(biāo)記葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG標(biāo)記物；鏈親和素可作為通用固定受體，與各種生物素化抗體結(jié)合用于檢測相應(yīng)的抗原性物質(zhì)。