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菌種的保藏是無菌檢驗(yàn)、微生物限度檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。用人工方法低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)等方法控制微生物的代謝，使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài)，繁殖受到抑制但仍保持菌種原有的各種生物學(xué)特性，以達(dá)到保種的目的。菌種保藏的關(guān)鍵是不變異、不污染、不死亡。
1.無菌檢驗(yàn)、微生物限度檢驗(yàn)用菌種的保藏與管理
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1.菌種保藏步驟
1.1挑選特征典型的純菌菌落。其方法是用接種環(huán)挑取少許菌苔，接種至2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環(huán)菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后可見單個(gè)菌落生長(zhǎng)。
1.2凡能產(chǎn)生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進(jìn)行保種。孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗。在傳代前，將菌液管放入80℃水浴中作用30分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。
1.3定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項(xiàng)目包括菌落形態(tài)、染色、鏡檢、生化特性及血清學(xué)檢查。
1.4選擇適宜的培養(yǎng)基及保藏方法。
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2.常用菌種的保藏方法
2.1普通瓊脂斜面 用于常用菌株的傳代。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。接種培養(yǎng)后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置4℃冰箱保存，每隔2～3個(gè)月傳種1次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，其菌種須放25℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存。
2.2半固體瓊脂 用于常用菌株的傳代。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養(yǎng)后，置4℃冰箱保存，6個(gè)月傳種1次。如在培養(yǎng)管內(nèi)加少量無菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發(fā)，可延長(zhǎng)菌種的保藏期。
2.3真菌瓊脂斜面 用于真菌的傳代。在真菌培養(yǎng)基內(nèi)按1.3%加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。
2.4沙氏瓊脂斜面 用于真菌的傳代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，瓊脂粉13g，加蒸餾水1000mL，待上述成分溶化后，搖勻分裝，115℃滅菌20分鐘，趁熱擺成斜面。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。
2.5 40％甘油水 用于細(xì)菌的傳代。配制方法：甘油40mL加水至100mL即成。分裝至試管內(nèi)，每支2mL左右，121℃滅菌20分鐘備用。接種細(xì)菌后直接放4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。
2.6需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基 用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1mL至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基15mL內(nèi)，30～35℃培養(yǎng)18～24h，置4℃冰箱內(nèi)保存3～6個(gè)月傳種1次。
2.7 皰肉培養(yǎng)基 用于破傷風(fēng)梭菌的傳代。取破傷風(fēng)梭菌CMCCB64067菌液0.1mL接種于皰肉培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)3～4天，置4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。
2.8 液氮超低溫保藏法 適用于各類微生物的保藏。液氮溫度可達(dá)-196℃，此時(shí)菌種的新陳代謝活動(dòng)已停止，但不會(huì)死亡。在配制好的菌液內(nèi)加10％甘油作為保護(hù)劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內(nèi)可保存10年之久。
2.9冷凍真空干燥保藏法 本法廣泛適用于各類微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護(hù)作用的介質(zhì)內(nèi)，分裝于滅菌菌種管內(nèi)，速凍后抽真空，使菌液很快變?yōu)槭杷傻母稍锞�，最后在真空狀態(tài)下密封管口，菌種保存期最長(zhǎng)可達(dá)20年以上。
2.10常用菌種的保藏條件及傳種時(shí)間，見表1。
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3．菌種檢查與復(fù)壯
菌種在傳代保藏過程中，易發(fā)生衰退、變異、污染和死亡，因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)使之復(fù)活，重新分離，純化形成單個(gè)菌落，再作菌種鑒定，包括菌落形態(tài)、顏色，染色性、鏡下觀察菌體形態(tài)等，必要時(shí)可做生化試驗(yàn)及血清學(xué)反應(yīng)。
菌種經(jīng)人工傳代保藏過程中，由于自發(fā)突變而引起特性變?nèi)趸蛳鶠榫N衰退。使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性，稱為菌種復(fù)壯。常用方法有：
①分離純化：將菌種接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，取菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后挑取典型單個(gè)菌落。
②宿主復(fù)壯：將退化菌種接種到相應(yīng)昆蟲或動(dòng)植物宿主體內(nèi)，傳種數(shù)代可恢復(fù)其原有的特性與毒力。
③抗逆復(fù)壯：通過極端的逆境處理使那些退化的細(xì)菌死亡，選育健壯的傳代保種。
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4．實(shí)驗(yàn)菌種的管理
菌種應(yīng)放入專用冰箱，實(shí)行雙人、雙鎖保管。菌種應(yīng)有購入記錄，傳代記錄，領(lǐng)用記錄和銷毀記錄。菌種應(yīng)定期檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退。菌種傳代應(yīng)不超過五代。
2.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng),它的各種生物特性都將發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化，因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。
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一、為避免污染造成的損失，在凍存細(xì)胞前，應(yīng)該檢查細(xì)胞是否污染以及細(xì)胞的密度和細(xì)胞的活力。
二、細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞的活力。緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶的形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
三、操作步驟
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(一)細(xì)胞凍存
1.配制含10%DMSO、10-20%小牛血清的凍存細(xì)胞培養(yǎng)液；
2.用胰蛋白酶將選好的細(xì)胞消化下來，消化時(shí)一定要掌握好消化的時(shí)間，如果時(shí)間處理不當(dāng)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，且細(xì)胞瓶中的胰酶殘留盡量倒干凈；
3.將消化好的細(xì)胞加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用注射器或吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻；
4.將細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，每管1~1.5mL；
5.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；
6.凍存的過程：將凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱過夜，取出凍存管移入液氮容器內(nèi)。
（二）細(xì)胞復(fù)蘇
1.佩戴厚點(diǎn)的手套，從液氮罐中取出凍存管快速直接放入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)使其在1分鐘內(nèi)快速融解；
2.在無菌下從水浴中取出凍存管，凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管或注射器吸出細(xì)胞懸液注入離心管中，由于離心管中細(xì)胞懸液較少所以再加入適量的培養(yǎng)液混勻；
3.離心，在1000rpm離心5min；
4.將離心管取出，棄去上清液，向離心管中加入含10%小牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液用吸管或注射器吹打后接種于培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜止置培養(yǎng)；
5.7~8小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)。
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四、注意事項(xiàng)
1.由于凍存的細(xì)胞還受其他因素影響，因此可能有部分死亡細(xì)胞，此時(shí)在換液時(shí)可將不貼壁和漂浮在培養(yǎng)液上已死亡的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)充新的培養(yǎng)液；
2.凍存和復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)最好用新配制的培養(yǎng)液；
3.凍存管存取時(shí)一定要做好防護(hù)工作，以免凍傷。
