Ⅰ、反應(yīng)體系

A、 抗體

1、 第一抗體：常用的或自備的抗體

a、 如果第一抗體或自備的抗體能夠進(jìn)行熒光標(biāo)記（如FITC，PE或其他），請(qǐng)參考直接染色步驟

b、 如果第一抗體不能進(jìn)行熒光標(biāo)記，則參考間接染色步驟

2、 第二抗體：經(jīng)熒光標(biāo)記過的多克隆抗體

B、 緩沖體系：PBS(Ca2 and Mg2 free,e.g.,Cat.#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)＋2%新鮮小牛血清（或者0.2%BSA）＋0.1%疊氮鈉

C、 HAB（e.g.,Cat.#50009,Irvine Scientific,CA），其他途徑購(gòu)買的經(jīng)熱失活的HAB或經(jīng)56℃失活1小時(shí)的HAB。將其分裝成小包裝并于-20℃貯藏。

Ⅱ、步驟

1、 將要檢測(cè)的樣品按常規(guī)的方法制成單細(xì)胞懸浮液。在最后的步驟中，用1ml預(yù)冷的緩沖液至少洗一次，再用預(yù)冷的緩沖液將細(xì)胞懸浮至濃度為1×107cells/ml（從而50μl=5×105cells）

檢測(cè)細(xì)胞活力是否達(dá)到90%。如果細(xì)胞活力低于90%，必須通過Ficoll-Hypaque分離法去除死細(xì)胞，否則死細(xì)胞會(huì)非特異地結(jié)合到抗體上的。更適宜的方法是將死細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀分析加以區(qū)分，以去除死細(xì)胞（具體請(qǐng)參考在通過流式細(xì)胞儀捕獲前在最后的重新懸浮細(xì)胞時(shí)加入propidium iodide或7-氨基-放線菌素D的方法）

2、 加入50μl的細(xì)胞懸浮液至離心管底部。

3、 在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上。

4、 然后加入適宜數(shù)量的單克隆抗體至離心管底部，置于冰上。

注意：進(jìn)行兩種或三種顏色染色時(shí)，請(qǐng)同時(shí)將所有的已經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體同時(shí)加入。

5、 輕輕振蕩后，于4℃下暗置30分鐘。

6、 用1ml的緩沖液洗兩次，然后置于4℃下以備通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行捕獲。

間接染色法

1-6、如前所述，用經(jīng)稀釋的未標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)細(xì)胞樣品處理；

7、 將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50μl的HAB中，混勻，于室溫中靜置1分鐘以上；

8、 加入50μl經(jīng)熒光標(biāo)記的第二抗體稀釋液；

9、 輕輕振蕩后于4℃下暗置20分鐘；

10、 用1ml的緩沖液洗兩次，于250g下離心5分鐘；

11、 將樣品重新懸浮于1ml緩沖液中，于4℃下避光保存待用。

注意：此法并不適用于Ig表面染色或用抗體直接對(duì)FC受體進(jìn)行染色。