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      簡易過碘酸鈉法制備HRP結(jié)合物

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

        本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結(jié)合,所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高,將近70%的HRP和Ig結(jié)合,99%的Ig與酶結(jié)合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前最常用的方法。

        1. 原理:經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連,形成斯夫氏鹼,后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

        2. 標記步驟:
        (1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
        (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室溫下避光攪拌20分鐘。
        (3) 將上述溶液裝入透析袋中,對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析,4℃過夜。
        (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗體,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避光輕輕攪拌2小時。
        (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃2小時。
        (6) 將上述液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4 PBS透析,4℃過夜。
        其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

        3. 結(jié)果判定:
        除標記物IgG量的計算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
        IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

        4. 試劑及器材:
        (1) 0.1M NaIO4:稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠,批號830602)溶于蒸餾水10ml中。
        (2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:
        0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
        0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
        加蒸餾水至2,000ml。
        (3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:
             Na2CO3 0.32克
             NaHCO3 0.586克
             加蒸餾水至50ml
        再用蒸餾水作20倍稀釋,即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

        (4) NaBH4溶液(4mg/ml):
        臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。

        (5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

       

       

       
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