1.酶標(biāo)抗體的制備
2.取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗,離心沉淀后,立即轉(zhuǎn)入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2,4℃固定5min~30min(依抗原性質(zhì)所定)。如病料為組織塊,則取適當(dāng)大小,先固定1h然后取出,以新的雙面刀片切成50~100µm的薄組織再行固定1h~2h。
3.漂洗 以PBS液漂洗過(guò)夜,換液3~4次。
4.血清孵育,25℃1h或4℃過(guò)夜,孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤內(nèi),底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固,不易洗脫,造成非特異性吸附。
5.PBS沖洗3~4次,每次10min。
6.2.5%戊二醛再固定15min~30min。
7.PBS液沖洗3~4次每次10min。
8.酶標(biāo)記抗體孵育;用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體(即工作濃度)于25℃濕盆內(nèi)孵育1h或4℃過(guò)夜。
9.PBS液沖洗3~4次每次10min或4℃漂洗過(guò)夜。
10.酶顯色處理 將漂洗后的標(biāo)本浸入DAB-H2O2底物溶液中,20℃,10min~30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。
11.常規(guī)包埋、切片、電鏡觀察 在經(jīng)過(guò)脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色,切片一般在2µm~4µm,切片后染色不存在通透困難的問(wèn)題。無(wú)論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色,最好在光鏡下定位選擇后,再做電鏡定位包埋,這樣目的性強(qiáng),可減少工作量。