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      非標記抗體免疫電鏡操作步驟

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

      1.經(jīng)典法
      (1)將被檢病毒材料0.9ml,加1︰5~1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。
      (2)置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃過夜。
      (3)以17 000r/min~23 000r/min離心90min。
      (4)吸去上清,將離心管口倒置于濾紙上,吸去殘留液體。
      (5)沉淀物中加少量H2O混懸,用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20Sec~30Sec,滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負染液。
      (6)在透射電鏡下4×104倍觀察。
      2.快速法(瓊脂擴散法)
      (1)同經(jīng)典法(1)、(2)步驟,制備免疫復合物。
      (2)以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖,趁熱澆注于潔凈的載玻片上,每片3ml,待冷卻凝固后,在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數(shù)粒,再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml~3ml,冷卻凝固后,取出玻璃珠,使凝膠形成凹孔。
      (3)將普通濾紙剪成2×3cm大小,3~4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上。
      (4)在凹孔內(nèi),加入制備好的含病毒的免疫復合物懸液。
      (5)將電鏡載網(wǎng)的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上。由于瓊脂糖的吸水作用,20min~30min后,可將液滴的水分吸干,而濃縮的免疫復合物則粘附在載網(wǎng)膜上。
      (6)在載網(wǎng)膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec,過量的負染液用濾紙在載網(wǎng)邊緣輕輕吸去。
      (7)于透射電鏡4×104倍下觀察。

       

       

       

       
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