1.標(biāo)記物 用于電鏡觀察的標(biāo)記物有三類:一類是電子密度致密的標(biāo)記物,如鐵蛋白、辣根過氧化物酶等。另一類則是放射性同位素,如135I、35S、32P、14C、3H等,第三類則是有獨(dú)特形狀的標(biāo)記物,如血蘭蛋白、噬菌體等。
對(duì)標(biāo)記物的要求是:具有特定的形狀、不影響抗原抗體復(fù)合物的特性與形狀。目前用于免疫電鏡的標(biāo)記物主要是鐵蛋白和HRP。兩者各有其優(yōu)點(diǎn),鐵蛋白電子密度致密。觀察時(shí)反差大,優(yōu)于酶標(biāo)記,但鐵蛋白分子量大(460 000),穿透能力差,所以適于細(xì)胞表面抗原的定位,另外鐵蛋白的標(biāo)記過程比較復(fù)雜。HRP分子量小(40 000),穿透力強(qiáng),有利于標(biāo)記抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),適于細(xì)胞內(nèi)的抗原定位。
2.固定劑 固定是免疫電鏡較關(guān)鍵的一步,免疫電鏡中的固定與一般超薄切片中的固定的不同之點(diǎn)在于既考慮保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),又要考慮到抗原的失活性問題。
(1)固定劑的要求:①不損害細(xì)胞內(nèi)抗原的活性;②固定速度快、效果好;③分子量小,易于滲透;④固定后,不引起交聯(lián),造成空間的阻礙,影響標(biāo)記抗體進(jìn)入抗原位。
(2)影響固定的因素有:①采用固定劑的種類;②固定劑的濃度,濃度過大,對(duì)抗原的活性有影響,濃度過小,固定效果差;③固定劑的pH;④固定劑的溫度,一般采用2℃~4℃冷固定;這樣能降低細(xì)胞的自浴作用和水分的抽提;⑤固定時(shí)間與溫度有關(guān),溫度高,固定快,也與緩沖系的離子強(qiáng)度有關(guān),離子強(qiáng)度大,滲透壓大,穿透力強(qiáng),固定要快。不同的固定劑,或同一固定劑的不同濃度所需的固定時(shí)間也不一致;⑥與被固定的細(xì)胞類型有關(guān)。
目前常用的固定系統(tǒng)有:4%聚甲醛,1.5%~2%戊二醛,1%多聚甲醛+1%戊二醛,4%多聚甲醛+0.5%苦味酸+0.25%戊二醛,96%乙醇+1%醋酸。不論采用哪些系統(tǒng),使用前必須用已知效價(jià)的抗原做一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。如固定劑的種類濃度、溫度、pH及固定時(shí)間等。然后做出預(yù)處理的效價(jià),作為失活參考以再選擇最適條件。
3.非特異性吸附 非特異性吸附與酶標(biāo)抗體、抗血清的稀釋度、染色時(shí)間,溫度及介質(zhì)等有關(guān),其中最主要的是抗血清及標(biāo)記抗體的稀釋。一般認(rèn)為高效價(jià)抗血清或標(biāo)記抗體稀釋到低蛋白濃度,用于標(biāo)記染色可獲得最理想的結(jié)果。因?yàn)榈偷鞍诐舛扔欣诮档头翘禺愋晕健?shí)際應(yīng)用的蛋白濃度大致在0.50mg/ml~2mg/ml。工作效價(jià)一般在1︰20~1︰400,在實(shí)際工作中,將標(biāo)記抗體或抗血清稀釋到1︰100倍以上則可獲得理想的陽性結(jié)果,而非特異性吸附必然降得很低。
工作濃度的選擇是將標(biāo)記抗體或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀釋,做已知陽性標(biāo)本的標(biāo)記染色觀察,取其陽性沉積物明顯,而非特異性吸附最低的一稀釋度做為工作濃度。
4.標(biāo)記染色法 標(biāo)記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點(diǎn)是特異性較高,敏感性低,標(biāo)記抗體只能用于檢測(cè)一種抗原。后者敏感性較強(qiáng),一種標(biāo)記抗體可用于多種抗原的檢測(cè)。缺點(diǎn)是特異性較差。