本階段是組織培養(yǎng)中最重要的一環(huán)。在培養(yǎng)基中植物激素的作用下，外植體通過(guò)三條途徑迅速增殖，這就是側(cè)芽增殖、誘導(dǎo)不定芽的形成和誘導(dǎo)胚狀體的形成。
側(cè)芽增殖
種子植物的每個(gè)葉腋中通常都存在著腋芽，在一定條件下可以使它生長(zhǎng)。現(xiàn)在知道頂端優(yōu)勢(shì)抑制側(cè)芽生長(zhǎng)，可被外源的細(xì)胞分裂素打破，所以在利用側(cè)芽增殖這條途徑時(shí)，培養(yǎng)基中幾乎都要加入細(xì)胞分裂素（有時(shí)也加入少量生長(zhǎng)素）。由于細(xì)胞分裂素的持續(xù)作用，側(cè)芽不斷分化和生長(zhǎng)，逐漸形成芽叢。如果反復(fù)切割和轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，就可在短期內(nèi)得到大量的芽。
側(cè)芽增殖的主要優(yōu)點(diǎn)是能保持遺傳的穩(wěn)定性，因?yàn)榍o尖的細(xì)胞常是均一的二倍體細(xì)胞，它不易受培養(yǎng)條件的影響而發(fā)生變異，也易于保持嵌合體的性狀。目前已有近百種植物可以用這種方法進(jìn)行繁殖，如草毒（Fragaria ananassa Duch.）、蘋果、葡萄（Vitis vinifera L.）、唐菖蒲（Gladiolus gandavensis Houtt.）、非洲菊、月季（Rosa chinensis Jacq.）、甜菜（Beta vulgaris L.）和鳳梨[Ananas comosus(L.) Merr.]等。
關(guān)于培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素的濃度，是0.1～10.0毫克/升，一般為1.0～2.0毫克/升。在幾種細(xì)胞分裂素中用的最多的是6-芐基嘌呤，其次是激動(dòng)素和異戎基腺苷，玉米素用的很少。
除了細(xì)胞分裂素之外，在培養(yǎng)基中還經(jīng)常加入低濃度的生長(zhǎng)素以促進(jìn)腋芽的生長(zhǎng)。常用的生長(zhǎng)素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸（濃度為0.1～1.0毫克/升）。
不定芽的誘導(dǎo)形成
在自然條件下，很多種植物的器官可以產(chǎn)生不定芽。在培養(yǎng)條件下，由于所需要的外植體很小又加上激素的作用，可以使這種產(chǎn)生不定芽的能力得到極好的發(fā)揮，如秋海棠或非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl.）用常規(guī)的葉插法繁殖時(shí)，每片葉只能產(chǎn)生幾個(gè)到十幾個(gè)芽，但用葉切段在培養(yǎng)基中可產(chǎn)生成千上萬(wàn)個(gè)芽。在培養(yǎng)條件下，還能使自然條件下不產(chǎn)生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜（Brassica oleracea L.var.capi-tata L.）和番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的葉、菊花[Dendranthema morifolium（Ram.） Tzvel.]的花和葉片、百合（Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker）和水仙的鱗片以及萱草（Hemerocallis fulva L.）的花莖等。
在誘導(dǎo)外植體形成不定芽時(shí)，一般使用細(xì)胞分裂素高于生長(zhǎng)素比值的激素配比，少數(shù)情況下也采用二者比值接近1的配比。常用的細(xì)胞分裂素是6-芐基嘌呤，激動(dòng)素和玉米素，濃度范圍一般在0.1～10.0毫克/升。生長(zhǎng)素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其濃度范圍與細(xì)胞分裂素相同。為了使外植體形成不定芽，外源激素的供應(yīng)只是一個(gè)方面，器官分化的性質(zhì)還要決定于內(nèi)源激素的狀況。因此，對(duì)于不同的植物，使用的激素種類和濃度常有較大的變化。在具體操作時(shí)，應(yīng)參考已有資料或相近種類的已有結(jié)果，以確定適當(dāng)?shù)臐舛群团浔取?/p>
胚狀體的誘導(dǎo)形成
在自然界只有少數(shù)植物可以由珠心產(chǎn)生胚狀體。在培養(yǎng)條件下，現(xiàn)在已有30多個(gè)科的150多種植物可以產(chǎn)生胚狀體。在誘導(dǎo)胚狀體的形成時(shí)，其外植體一般取自胚、分生組織或生殖器官。為了獲得胚狀體，在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中應(yīng)含有豐富的還原氮，并加入生長(zhǎng)素（主要是2，4-D）誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生。待胚狀體發(fā)生后，要轉(zhuǎn)移到降低濃度或沒有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使胚狀體成熟和生長(zhǎng)。
胚狀體途徑的優(yōu)點(diǎn)是增殖率高，而且胚狀體既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根這一步驟。但目前很多重要作物還不能形成胚狀體，或產(chǎn)生的胚狀體難以形成植株，另外胚狀體遺傳性也容易發(fā)生變異，所以目前除柑桔（Citrus）、油棕（Elaeis guine-ensis Jacq.）和咖啡（Coffea）等少作物外，都不采用這一途徑。