★植物組織培養(yǎng)（Plant Tissue Culture）：是指通過無菌操作分離植物體的一部分（外植體explant），接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下（包括營養(yǎng)、激素、溫度、光照、濕度）進行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。（主要有原生質(zhì)體（Protoplast），懸浮細胞，組織（愈傷組織Callus、莖尖分生組織），器官（胚，花藥，子房，根和莖）的培養(yǎng)。其中最常見的是愈傷組織培養(yǎng)。）
★愈傷組織（Callus）：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組培中則指人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞。
★植物細胞全能性（Cellular totipotency）：任何具有完整細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植珠所必須的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。（Haberlandt, 1902）
★微（快）繁步驟（micropropagation）：
母株（完整）→外植體（母株的一小部分，種子亦可）→接種到培養(yǎng)基上→長芽（繼代增殖）→長根（試管外生根亦可）→練苗，馴化→完整植株
★組培發(fā)展簡史：細胞學(xué)說：Schleiden和Schwann。1.探索：20世紀初，Haberlandt提出“細胞全能性” （1902）；1904年，Hanning培養(yǎng)蘿卜和辣根菜的胚成功；Laibach（1925,1929）亞麻種間雜種胚培養(yǎng)成功，證明胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交上可利用；1922年，Robiins（美）和Kotte（德）離體根尖培養(yǎng)成功。2.奠基：Gautheret，White和Nobecourt，組培奠基人。White和Gautheret發(fā)現(xiàn)了 B族維生素和生長素；Skoog（1944）和Skoog和崔 （1951）等發(fā)現(xiàn)腺嘌呤和生長素的比例控制芽和根的形成，Overbeek等（1941）首次將椰子汁（CM）作為添加劑，Steward等在胡蘿卜組培也使用CM；1952年，Morel和Martin首次證實通過莖尖離體培養(yǎng)可獲無病毒植株；1953-1954年，Muir單倍體培養(yǎng)獲得成功；1955年，Miller分離出激動素（KT）；1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；1958年，Steward首次證實Haberlandt的細胞全能性設(shè)想；Wickson和Thimann指出CTK打破腋芽休眠；Murashige發(fā)展快繁技術(shù)；1958-1959年，Reinert和Steward胡蘿卜愈傷組培中形成體細胞胚。3.迅速發(fā)展：1971年，Takebe首次由煙草原生質(zhì)體獲得再生植株；1972年，Carlson獲得煙草的第一個體細胞雜種；1964年，Guha和Maheshwari由毛曼佗羅離體花藥培養(yǎng)胚；1960年，Morel提出離體無性繁殖蘭花。……（具體see see書本或課件）
★組培意義：1、基礎(chǔ)理論研究（試驗體系的準確性和可重復(fù)性，廣泛用于細胞、組織的代謝生理及其它生化等方面的研究（如分化問題））。2、應(yīng)用研究（無性繁殖系快速繁殖的生產(chǎn)、試管苗的商品化，遺傳育種，種質(zhì)保存，克服遠緣雜交，種質(zhì)資源創(chuàng)新，獲得轉(zhuǎn)基因植株）。
★組培應(yīng)用前景：1、作物育種上的應(yīng)用（1、花藥和花粉培養(yǎng)2、胚胎培養(yǎng)3、細胞融合4、基因工程5、培養(yǎng)細胞突變體6、種質(zhì)保存）2、作物脫毒和快繁上的應(yīng)用（馬鈴薯，蘭花）3、在植物有用產(chǎn)物生產(chǎn)上的應(yīng)用4、在遺傳、生理、生化和病理研究上的應(yīng)用。
★植物激素調(diào)控：auxin/CTK >1(促進生根) ；=1(愈傷組織) ；<1(促進發(fā)芽)
★脫分化（dedifferentiation）：在組織培養(yǎng)中，不分裂的靜止細胞，放在一定的培養(yǎng)基上后，細胞重新進入分裂狀態(tài)。一個成熟的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程叫脫分化。
★再分化（redifferentiation）：一個成熟的植物細胞經(jīng)歷了脫分化后，能再分化而形成完整植株的過程。
★再分化途徑：1、器官發(fā)生方式（是指在外植體或愈傷組織的不同部位分別獨立形成莖、芽和根，它們?yōu)閱螛O性結(jié)構(gòu)，各有維管束與外植體或愈傷組織相連，但在不定芽和不定根之間沒有共同的維管束將兩者連在一起。）2、胚胎發(fā)生方式（外植體直接或通過愈傷組織或懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。）
★胚狀體（embryoid）：是指在組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。其特點有：1、不同于合子胚，因為它不是兩性細胞融合產(chǎn)生。2、不同于孤雌/雄胚，因為它不是無融合生殖的產(chǎn)物。3、不同于器官發(fā)生方式形成的莖芽和根，因為它經(jīng)歷了與合子胚相似的發(fā)育過程且成熟的胚狀體是雙極性結(jié)構(gòu)。
★器官發(fā)生途徑：1、莖尖或莖段培養(yǎng)產(chǎn)生腋芽。2、直接不定芽發(fā)生：器官的小塊組織在培養(yǎng)基上培養(yǎng)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。3、間接不定芽發(fā)生：器官的小塊組織在培養(yǎng)基上培養(yǎng)后先去分化形成愈傷組織，再經(jīng)分化誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽或不定根。
★胚胎發(fā)生方式：1、直接胚胎發(fā)生（從培養(yǎng)物中的器官組織，細胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織）2、間接胚胎發(fā)生（外植體先愈傷化，然后由愈傷組織細胞分化成熟）
球型胚（global embryo）→心型胚（heart-stage embryo）→魚雷型胚（torpedo-stage embryo）→子葉型胚（cytoledon-stage embryo）
★人工種子：是指利用細胞的全能性將離體培養(yǎng)所產(chǎn)生的體細胞或具有發(fā)育成完整植株能力的分生組織（胚狀體，莖和莖段）包裹在一層含有營養(yǎng)物質(zhì)并具有保護功能的外膜內(nèi)形成在適宜條件下能夠發(fā)育成完整植株的小顆粒。
結(jié)構(gòu)包括人工種皮，胚狀體（分生組織），人工胚乳。
★植物組織培養(yǎng)應(yīng)用步驟：1、獲得無菌外植體，建立起無菌培養(yǎng)體系。2、進行增殖，不斷產(chǎn)生不定芽或胚狀體。3、生根培養(yǎng)。4、試管苗移栽。
★外植體選擇的原則：1、必須含有活細胞。2、幼嫩組織所含活躍分裂的細胞比例高。3、母珠必須健康并且無任何腐爛或生病的跡象。4、母珠必須活躍生長并且不會立即進入休眠。
★外植體的確定選擇：1、莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限）；2、莖段（采用嫩莖的切段促進腋芽萌發(fā)，取材容易）；3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產(chǎn)生植株，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）；4、花球和花蕾；5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。
★消毒的原則：消毒劑與外植體應(yīng)接觸足夠長的時間以除去外植體表面的微生物，但應(yīng)盡量減少對外植體細胞的破壞。
★消毒方法：沖洗植物材料除去泥土等大的顆粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸濕→用5-20％NaClO溶液（加1滴表面活性劑）表面消毒5-10min→用無菌水沖洗至少3遍→與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)基前應(yīng)切去，因為消毒劑會殺死外露的細胞從而影響營養(yǎng)吸收→切取外植體，通常為10mm的莖段和直徑10mm的葉片部分（太大激素作用減弱，太小則不易成活）。
★消毒注意事項：1、表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。2、在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。3、與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，因為消毒劑會阻礙植物細胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。4、若外植體污染嚴重則應(yīng)先用流水漂洗1小時以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養(yǎng)。5、HgCl2效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖洗至少5次。
★莖尖培養(yǎng)：切取莖的先端部分或莖的分生組織部分進行無菌培養(yǎng)。
步驟：無菌培養(yǎng)的建立→芽的誘導(dǎo)→生根培養(yǎng)→試管苗的移栽（遺傳變異）
注意點：試管苗移栽過程中，由異養(yǎng)→自養(yǎng)，恒溫→溫差，無菌→有菌，光弱→光強，濕度高→濕度低，應(yīng)該保持苗的水分平衡（加塑料薄膜和使用噴霧機），選擇適當?shù)幕�質(zhì)，注意光、溫的條件。
★安祖花：葉片→誘導(dǎo)愈傷組織→誘導(dǎo)芽→誘導(dǎo)根 生根
↓ ↑
增殖→切根→芽的增殖→再培養(yǎng)→壯苗→生根之前
不定胚的誘導(dǎo)：組織片→含有2,4-D的培養(yǎng)基上→產(chǎn)生不定胚→去除2,4-D的培養(yǎng)基上→球型胚→心型胚→魚雷型胚→植物體。
不定芽的誘導(dǎo)：用BA誘導(dǎo)，在球、心、魚雷時要去除BA。
★胚胎培養(yǎng)的意義：1、對于胚乳發(fā)育不良或胚與胚乳間不親和的材料進行離體胚培養(yǎng)，有助于遠緣雜交獲得成功。2、為研究胚在各個發(fā)育時期的營養(yǎng)需要提供了一個很好的機會。3、能對整個胚及其各部分的再生潛力進行研究。
★胚培養(yǎng)中的兩個重要問題：1、胚剝離的方法：剝離的最佳時間是授粉后13-15天。2、培養(yǎng)基的成分：找到合適的培養(yǎng)基，在胚培養(yǎng)中加入蔗糖（能源、保持適當滲透壓）。
★花藥培養(yǎng)方法：
取材地點：大田和溫室
取材：大多采用單核期的花粉培養(yǎng)，因誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體的頻率較高。
花粉時期的確定：常采用醋酸洋紅-碘化鉀染色，再壓片鏡檢。實際操作中常根據(jù)花蕾長度、大小與花粉年齡的相關(guān)性確定。
預(yù)處理：低溫、高溫或交叉處理
培養(yǎng)基：有MS，Nitsch，Miller，B5和N6。低濃度的生長素和細胞分裂素相結(jié)合，高濃度的蔗糖對花粉的誘導(dǎo)生長有一定作用。培養(yǎng)基中加入活性炭對提高誘導(dǎo)頻率也有一定效果。
消毒、接種和培養(yǎng)：花藥→在燒杯中研碎（有溶劑）→過濾→濃度梯度離心→收集中間層→離心
單倍體的鑒定和加倍處理：單倍體用2％秋水仙素處理24小時，愈傷組織細胞自然加倍。
★花粉花藥培養(yǎng)的意義：1、在單倍體細胞中只有一個染色體組，表現(xiàn)型和基因型一致，一旦發(fā)生突變，無論是顯性還是隱性，在當代就可表現(xiàn)出來，因此單倍體是體細胞遺傳研究和突變育種的理想材料。2、在品種間雜交育種過程中，通過F1代花藥培養(yǎng)得到單倍體后，經(jīng)染色體加倍立即成為純合二倍體，從雜交到獲得不分離的雜種后代單株只需要2個世代和常規(guī)育種相比，顯著縮短了育種年限。
★花藥培養(yǎng)步驟（用改良的NLN培養(yǎng)基）：
F1代花藥→形成小孢子→分離小孢子→形成愈傷組織→形成胚→單倍體植株→純合二倍體
↓
形成胚→單倍體植株→染色體加倍形成純合二倍體
★原生質(zhì)分離：酶（纖維素酶，離析酶）
步驟：葉片表面消毒→去除表皮→葉碎片漂浮在含有酶和滲透壓穩(wěn)定劑的溶液中→培育→原生質(zhì)體沉到培養(yǎng)皿底部→除去酶溶液→將原生質(zhì)體移入CPW清洗→離心→清洗基質(zhì)兩次→重懸浮于培養(yǎng)基→除去小的個體，用血球計計數(shù)→調(diào)整到合適的密度重懸浮于培養(yǎng)基。
★原生質(zhì)體的培養(yǎng)：
培養(yǎng)基：MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇
注意：1、原生質(zhì)體分離后，非常脆弱，需要滲透壓保護劑的保護直到細胞壁形成。
2、針對不同的研究對象，培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的水平要做適當調(diào)整。
影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素：營養(yǎng)需求（NH4＋不能過多），滲壓劑，培養(yǎng)密度（105/mL），
貯藏條件（通常在黑暗處）。
培養(yǎng)方法：液體基質(zhì)培養(yǎng)法，半液體基質(zhì)培養(yǎng)法，固體基質(zhì)培養(yǎng)法，看護培養(yǎng)。
固體培養(yǎng)的步驟：原生質(zhì)體移入培養(yǎng)基→1體積含原生質(zhì)體的培養(yǎng)基與1體積含瓊脂糖（40℃）的培養(yǎng)基混和→倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿在25℃下培養(yǎng)→原生質(zhì)體重新產(chǎn)生細胞壁并分裂成細
胞團→細胞團于瓊脂糖基質(zhì)中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基中應(yīng)減少滲壓劑以利于愈傷組織的形成→誘導(dǎo)分化成植物的根，莖。
★原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的意義：1、除去了細胞壁為植物細胞之間的融合掃平了障礙，同時葉為制造新雜種開辟了道路。2、原生質(zhì)體可攝入外源DNA，細胞器、細菌或病毒顆粒，這些特性與植物全能性相結(jié)合為高等植物的遺傳飾變打下基礎(chǔ)。3、獲得細胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料。
★原生質(zhì)的融合概念：從同一個種或不同種分離得到的原生質(zhì)體在適當?shù)臈l件下融合得到細胞核物質(zhì)和細胞質(zhì)物質(zhì)的混和。
★體細胞雜交：完全不經(jīng)過有性過程，只通過體細胞融合制造雜種的方法稱為體細胞雜交。
★原生質(zhì)體融合方法：自發(fā)融合，誘發(fā)融合（NaNO3處理，高PH-高濃度鈣離子處理，PEG處理，電融合）
PEG法：
取材（1、從綠色葉片上分離得到的原生質(zhì)體。2、來源于同種或不同種的細胞懸浮培養(yǎng)物上分離出的無色原生質(zhì)體）－這樣異核體和母體就可分辨開。
→分別取在含有13％甘露醇的CPW上懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體（密度2×105）4mL，混和在100g的轉(zhuǎn)速下離心10min，將原生質(zhì)體放入0.5％基質(zhì)→加入30％（w/v）PEG 2mL，使原生質(zhì)體的外膜不穩(wěn)定，放置10min→每隔5min加入原生質(zhì)體培養(yǎng)基稀釋PEG以促進原生質(zhì)體融合。每次稀釋后輕微搖動原生質(zhì)體就會重懸浮→混和物在100g下離心10min，離心后在不含PEG的培養(yǎng)基中清洗→離心，在相同的培養(yǎng)基上重懸浮。
PEG法的缺點：有毒，融合率低：不超過1％
對稱融合：父母均未處理，對后代貢獻一樣。
不對稱融合：父母本在后代中貢獻不同，射線處理，化學(xué)處理
IOA（不影響核的分裂而影響細胞質(zhì)分裂）
★胞質(zhì)雜種：利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，使兩種不同來源的核外遺傳成分（細胞器）與一個特定的核基因組結(jié)合在一起，就形成胞質(zhì)雜種。
體細胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定方法：形態(tài)學(xué)，細胞學(xué)，分子遺傳學(xué)。
★園藝植物脫毒：
熱處理脫毒：
原理：在高于正常溫度下，植物組織中的很多病毒可被部分或完全鈍化，而很
少傷害甚至不傷害寄主組織。
方法：熱水處理（對休眠芽效果好），熱空氣處理（對活躍生長的莖尖效果好）
熱空氣處理方法：空氣溫度35-40℃，持續(xù)時間：隨處理對象不同而變化，幾分鐘-幾星期。
注意點：不能一下子放入高溫中，要逐步加溫使之適應(yīng)。并保持濕度和光照。
局限性：1、并不是所有的病毒都對熱處理敏感
2、對等徑和線狀的病毒及類菌質(zhì)體引起的病害是有效的。
3、熱處理后只有一小部分植株能夠存活
★莖尖分生組織：指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約100μm，最大長度為
250μm。
★莖尖：由頂端分生組織及其下方的1-3個葉原基一起構(gòu)成的。
★莖尖培養(yǎng)脫毒：
原理：病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在受感染的植物中頂端分生組織通常不含或僅含低濃度的病毒，其它的植物組織離莖尖的距離越遠則病毒含量越高。
影響莖尖培養(yǎng)脫毒效果的因素：培養(yǎng)基，外植體大�。�脫毒效果跟外植體大小呈負相關(guān)，莖尖的成活率與莖尖大小呈正相關(guān)），貯存條件（光照培養(yǎng)優(yōu)于暗培養(yǎng)），外植體的生理狀態(tài)（活躍生長的芽，頂芽的效果比腋芽好，切割芽的時間）
★通過愈傷組織培養(yǎng)脫毒：
原理：在由受感染的組織形成的愈傷組織中，并非所有的細胞都均勻一致地帶有該種病原體。
產(chǎn)生原因：1、病毒的復(fù)制速度跟不上細胞的增殖速度
2、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的特征。
★脫毒植物的鑒定：外觀判斷法，指示植物法（接種鑒定法），抗血清鑒定法，電鏡檢查法，
分光光度法，酶聯(lián)血清免疫吸附反應(yīng)鑒定法。
指示植物法：利用病毒在其它植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒的標準。
指示植物：專門選用以產(chǎn)生局部病斑的寄主稱為指示植物。
★無毒原種的保存：種在溫室或防蟲罩內(nèi)滅過菌的土壤中，隔離區(qū)內(nèi)，通過組織培養(yǎng)繁殖。
組培常見英漢對照
abortion（敗育）adenine（腺嘌呤）agar （瓊脂）anther（花粉）apical（頂端的）aseptic(無菌的) auxin（生長素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈傷組織）cellular totipotency（細胞全能性） cellulase（纖維素酶）cellulose（纖維素）centrifuge（離心）chloroplast（葉綠體） chromosome doubling（染色體加倍）colony（細胞團，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞質(zhì)雜種） cytokinin（細胞分裂素） cytoplasm（細胞質(zhì)）degeneration （敗育）dedifferentiation （脫分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（雙子葉的）dihaploid（二單倍體）diploid（二倍體）dissect（剝離）dormancy（休眠）eliminate （除去） embryo（胚胎）embryoid（胚狀體）embryogenesis（胚胎發(fā)生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植體）filter paper（濾紙） gelose（瓊脂糖）genetype（基因型）germplasm（種質(zhì)） global embryo （球型胚） haploid（單倍體）heterokaryon（異核體）homozygous（純合的）hormone （激素）interspecific（種間的）intraspecific（種內(nèi)的）in vitro（體外）in vivo（活體）kinetin（激動素）macerozyme（離析酶）male sterile（雄性不育）medium（培養(yǎng)基）membrane（膜）meristem（分生組織）meristem culture（莖尖培養(yǎng)）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（單子葉植物） nod culture （莖段培養(yǎng)）organelle（細胞器）organgenesis（器官發(fā)生方式）osmotic（滲透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture（花粉培養(yǎng)）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球莖protoplast fusion（原生質(zhì)體融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不親和） shoot tip（莖尖） sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（體細胞胚）somatic hybridization（體細胞雜交）somatic hybrid（體細胞雜種）stem（莖）stem tip culture（莖尖培養(yǎng)）sterilant（消毒劑）sterile distilled water（蒸餾水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (繼代) sucrose（蔗糖） terminal bud（頂芽）transfer （轉(zhuǎn)移）virus eradication（脫毒）
常用縮略語
ABA（脫落酸） CM（椰子汁） CPW（細胞-原生質(zhì)體清洗液）
DMSO（二甲基亞砜） IAA（吲哚乙酸） IBA（吲哚丁酸）
KT（激動素） NAA（萘乙酸） PEG（聚乙二醇）
LH（液氮） CH（水解酪蛋白） GA3（赤霉素）