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一、菌總數(shù)的念和測定意義
菌落(colony)是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上發(fā)育而形成的能被肉眼所識別的生長物,它是由數(shù)以萬計的相同細(xì)菌聚集而成的,故又有細(xì)菌集落之稱。
菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)或表面積(clni)內(nèi),、所含能于某種固體培養(yǎng)上,在一定條件下培養(yǎng)后所生成的細(xì)菌菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)記,也可以應(yīng)用這一方法觀察食品中細(xì)菌的性質(zhì)以及細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài).以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供科學(xué)依據(jù)。
二、菌落總數(shù)測定的幾項(xiàng)說明
1.菌落總數(shù)的測定。是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營養(yǎng)瓊脂混合后,每個細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20%),因而并不能測出每g或ml檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù),厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長,有特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制,因此所得結(jié)果,只包括一群能在普通營養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。
2.鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個,成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在,因而在營養(yǎng)瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊,也可以來源于單個細(xì)胞,因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數(shù)字不應(yīng)報告活菌數(shù),而應(yīng)以單位重量、容量或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位數(shù)( colony forming units,CFU)報告之。3.每種細(xì)菌都有它一定的生理特性,培養(yǎng)時,應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件(如溫度、培養(yǎng)時間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求,才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。因此,要得到較全面的細(xì)菌菌落總數(shù),應(yīng)將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基上,并培養(yǎng)在不同條件下,如溫度,氧氣供應(yīng)等。但國家頒發(fā)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對不同食品的菌落總數(shù)的規(guī)定,都是根據(jù)用普通營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行需氧培養(yǎng)所得的結(jié)果確定的，因此在食品的一般衛(wèi)生學(xué)評價中并不要用幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。
三、菌落總數(shù)的測定
測定食品中菌落總數(shù)時,是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內(nèi)與營養(yǎng)瓊脂相混合,經(jīng)培養(yǎng)后,按一定要求計算出皿內(nèi)瓊脂平板上所生成的細(xì)菌集落數(shù),并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù),計算出每g或ml樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。
四、菌落總數(shù)測定中的一些要求和規(guī)定
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗(yàn)時必須遵循以下一些要求和規(guī)定。
(一)所用器皿及稀釋液
1.檢驗(yàn)中所用玻璃器皿,如培養(yǎng)皿,吸管、試管等必須是完全滅菌的,并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2.用作樣品稀釋的液體,每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個菌落時,要追加對照平板,以判定是空白稀釋液,用于傾注平皿的培養(yǎng)基,還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3.檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水,但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1%蛋白胨水為合適,因蛋白胨水對細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用,不會因?yàn)樵谙♂屵^程中使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)死亡。如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋,則宜采用蒸餾水。
(二)檢樣稀釋
1.檢樣稀釋時,應(yīng)無菌稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或ml)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠),經(jīng)充分振搖作成1:10的稀釋液。
如肉、魚等固體樣品,最好剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻,或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中，以8000-10000rpm速度攪拌1分鐘,使做成均勻的1:10稀釋液。
2.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計,將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1ml與9ml稀釋液混和做成1:100的稀釋液,然后依次遞増稀釋,做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次,必須另換1支1ml滅菌吸管,這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
3.從吸管筒內(nèi)取出滅吸管時,不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時,也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分:因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
4.在作10倍遞増稀釋中,吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時,應(yīng)先高于吸管刻度,然后提起吸管尖端離開液面,將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度,這樣取樣較準(zhǔn)確,而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時不會有多余的液體粘附于管外。
5.當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時,應(yīng)小心沿管壁加入,不要觸及管內(nèi)稀釋液,以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
（三）平板接種與培養(yǎng)
1.將稀釋液加至滅菌平皿時，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液加入皿內(nèi)（從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋），最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應(yīng)做2個平皿。
2.用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45土1℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時,每皿內(nèi)傾入的1.5ml，最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3.為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落,在檢液加入平皿后,應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂,并立即使其與瓊脂混和均勻。
4.檢樣與瓊脂混和時,可將皿底在平面上先向一個方向旋轉(zhuǎn),然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn),以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心,不要使混和物到皿邊的上方。為了保證混和均勻,而不濺及皿邊的上方,可使用自動平皿旋轉(zhuǎn)儀,直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)位上(可同時放4只平皿),加入瓊脂后,開動電鈕,在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動左右旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣與瓊脂混合均勻。
5.皿內(nèi)瓊脂凝固后,不要長久放置,然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng);而應(yīng)于瓊脂凝固后,在數(shù)分鐘內(nèi)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng),這樣可避免菌落蔓延生長。必要時,可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后,再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動性強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長。
6.為了控制污染,在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時,于工作臺上打開一塊瓊脂平板,其暴露的時間,應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴落的最長的時間相當(dāng),然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng),以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。
7.培養(yǎng)溫度,應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng),水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為48±2小時。其他食品,如清涼飲料,調(diào)味品,糖果、糕點(diǎn)、果脯、酒類(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌菜均系用37℃ 24±2小時培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時間之所以有這種不同的區(qū)分,是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時,分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數(shù)據(jù)。水產(chǎn)品因來自淡水或海水,水底溫度較低,因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時,用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
(四)對照試驗(yàn)
1.加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液(特別是10-1的稀釋液),有時帶有食品顆粒,在這種情況下,為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿,不經(jīng)培養(yǎng),而于4℃環(huán)境中放置,以便在計數(shù)檢樣菌落時用作對照。
2.為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已融化而保溫于45℃水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100ml加1ml 0.5%TTC水溶液。培養(yǎng)后，如食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落，配好的TTC溶液，應(yīng)先用來與不加TTC的做對照，以觀察其對計數(shù)是否有不利的作用（TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用）。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏（formazan），使菌落呈現(xiàn)紅色。
（五）菌落計數(shù)
1.從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計數(shù)時,應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗(yàn)的2個平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近,不同稀釋度的幾個平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比,即檢樣稀釋倍數(shù)越大,菌落數(shù)越低,稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
2.計數(shù)菌落時,應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。1個稀釋度使用兩個平板,應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)：如其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù),若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個稀釋度的兩個平板中,一個平板的菌落數(shù)在30-300之間,另一個大于300或小于30時,則以菌落數(shù)在30~300間的平板作為計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。
3.菌落計數(shù)所得結(jié)果,可分別按以下幾種不同情況作報告。
(1)若1個稀釋度的平均菌落數(shù)在30-300之間,則將該菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報告之。
(2）若有兩個稀釋度,其生長的菌落數(shù)均在30~300之間・則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應(yīng)報告其平均數(shù),例如2:46000/29500=1.6＜2,故報告為:(46000+29500)/2=37750或3.8×104。若大于2,則報告其中較小的數(shù)字,如3:6000/27100=2.2＞2，故報告為:27100或2.7×104。若等于2,亦報告其中較小的數(shù)字,如4:3000/1500=2,故報告為:1500或1.5×103。
(3)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之，如報告為:313×108=313000或3.1×105。
(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以選擇的稀釋度。
(5)若所有稀釋度均無菌落生長,則以小于1(＜1)乘以最低稀釋倍數(shù)報告之,如報告為1×10,或＜10。
(6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間,其中一部分大于300或小于30時,則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。
4.注意事項(xiàng)
(1)如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高,則系檢驗(yàn)工作中發(fā)生的差錯,屬實(shí)驗(yàn)室事故。此外,也可能因抑菌劑混入樣品中所致,均不可用作檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。
(2)如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落,菌落之間沒有明顯的界限,這是在瓊脂與檢樣混合時,一個細(xì)菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計,如有來源不同的幾條鏈,每條鏈作為一個菌落計,不要把鏈上生長的各個菌落分開來數(shù)。此外,如皿內(nèi)瓊脂凝固后未及時進(jìn)行培養(yǎng)而遭受昆蟲侵入,在昆蟲爬過的地方也會出現(xiàn)鏈狀菌落,也不應(yīng)分開來數(shù)。
(3)如果所有平板上都有菌落密布,不要用多不可計作報告,而應(yīng)在稀釋度最大的平板上,任意數(shù)其中2cm2個,除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6cm2數(shù),再乘其稀釋倍數(shù)作報告。例如10-1~10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布,而在10-3稀釋的平板上任數(shù)2個cm2內(nèi)的菌落數(shù)是60個,皿底直徑為9cm,則該檢樣每g(或ml)中“估計”菌落數(shù)為:60/2×63.6×1000=19080001.9×106。63.6cm2數(shù)系按皿底直徑為9cm時計算而得,即:(9/2)2×3.14=63.6:如所用平皿的皿底直徑不是9cm,則可按其直徑的實(shí)際cm數(shù)代人圓面積公式求出。
(5)檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料),則平板計數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除,不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告,一般在校正檢樣的pH7.6后,再進(jìn)行稀釋和培養(yǎng),此類嗜酸性微生物往往即不易生長，并可用革蘭氏染色鑒別。染色鑒別時，要用不矯正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所成的菌落涂片染色作對照，用以辨別。酵母菌卵圓形，遠(yuǎn)比細(xì)菌大，大小為2~5×5~30um，革蘭氏陽性著色，乳酸桿菌在24小時內(nèi)，于普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。
（五）報告方式
1、當(dāng)檢樣的菌落數(shù)為1-100時,按實(shí)有數(shù)報告:大于100時,只記錄左面頭兩位數(shù)字(用兩位有效數(shù)字作報告,可避免產(chǎn)生虛假的精確概念)。左面第三位數(shù)字則用四舍五入法計算,從第二位數(shù)字之后都記為0，為了縮短數(shù)字后面的0數(shù),也可用10的指數(shù)來表示,例如菌落數(shù)為37750時,即可寫成3.8×105。
2.檢樣的菌落數(shù)如系從菌落密布的平板上按比例計算而求得,報告結(jié)果時,應(yīng)在菌落數(shù)前加上“估計”二字。
3.檢樣為固體,用重量法取樣檢驗(yàn)時,以g為單位報告其菌落數(shù)；檢樣為液體,用容量法取樣檢驗(yàn)時,以ml為單位報告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液,則應(yīng)以cm2為單位報告其菌落數(shù)。4.如檢樣為液體,在兩個平皿內(nèi)所加1ml未經(jīng)稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中,均無細(xì)菌集落生成,則報告為1ml檢樣內(nèi)未有菌落生長,或1ml檢樣內(nèi)菌落數(shù)＜1。
五、特殊的方法
(一)平板表面涂布法
將營養(yǎng)瓊脂制成平板,經(jīng)50℃ 1-2小時或35℃ 18-20小時干燥后,于其上滴加檢樣稀釋液0.2ml,用L棒涂布于整個平板的表面,放置片刻(約10分鐘),將平板翻轉(zhuǎn),移至36土1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24土2小時(水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)48土2小時),取出,按前述方式進(jìn)行菌落計數(shù),然后乘以5(由0.2ml換算為1ml),再乘以樣品稀釋的倍數(shù),即得每g或ml檢樣所含菌落數(shù)。
此法較上述傾注法為優(yōu),因菌落生長在表面,便于識別和檢查其形態(tài),雖檢樣中帶有食品顆粒也不會發(fā)生混淆,同時還可使細(xì)菌不必遭受融化瓊脂的熱力,不致因此而使菌細(xì)胞受到損傷而不生長,從而可避免由于檢驗(yàn)操作中的不良因素而使檢樣中細(xì)菌菌落數(shù)降低。但是本法取樣量較傾注法為少(僅傾注法的五分之一），代表性將受到一定的影響。
(二)平板表面點(diǎn)滴法與涂布法相似。所不同者,只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴(使每滴相當(dāng)于0.025ml)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域(預(yù)先在平板背面用標(biāo)記筆劃成四個區(qū)域),每個區(qū)域滴1滴,每個稀釋度滴兩個區(qū)域,作為平行試驗(yàn)。滴加后,將平板放平片刻(約5~10分鐘),然后翻轉(zhuǎn)平板,如前移入溫箱內(nèi)培養(yǎng)6~8小時后進(jìn)行計數(shù),將所得菌落數(shù)乘以40(由0.025ml換算為1ml),再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得每g或ml檢樣所含菌落數(shù)。本法具有快速、節(jié)省人力物力，但此法取樣量少，代表性可能受到影響。
菌落(colony)是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上發(fā)育而形成的能被肉眼所識別的生長物,它是由數(shù)以萬計的相同細(xì)菌聚集而成的,故又有細(xì)菌集落之稱。
菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)或表面積(clni)內(nèi),、所含能于某種固體培養(yǎng)上,在一定條件下培養(yǎng)后所生成的細(xì)菌菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)記,也可以應(yīng)用這一方法觀察食品中細(xì)菌的性質(zhì)以及細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài).以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供科學(xué)依據(jù)。
二、菌落總數(shù)測定的幾項(xiàng)說明
1.菌落總數(shù)的測定。是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營養(yǎng)瓊脂混合后,每個細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20%),因而并不能測出每g或ml檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù),厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長,有特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制,因此所得結(jié)果,只包括一群能在普通營養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。
2.鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個,成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在,因而在營養(yǎng)瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊,也可以來源于單個細(xì)胞,因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數(shù)字不應(yīng)報告活菌數(shù),而應(yīng)以單位重量、容量或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位數(shù)( colony forming units,CFU)報告之。3.每種細(xì)菌都有它一定的生理特性,培養(yǎng)時,應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件(如溫度、培養(yǎng)時間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求,才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。因此,要得到較全面的細(xì)菌菌落總數(shù),應(yīng)將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基上,并培養(yǎng)在不同條件下,如溫度,氧氣供應(yīng)等。但國家頒發(fā)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對不同食品的菌落總數(shù)的規(guī)定,都是根據(jù)用普通營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行需氧培養(yǎng)所得的結(jié)果確定的，因此在食品的一般衛(wèi)生學(xué)評價中并不要用幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。
三、菌落總數(shù)的測定
測定食品中菌落總數(shù)時,是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內(nèi)與營養(yǎng)瓊脂相混合,經(jīng)培養(yǎng)后,按一定要求計算出皿內(nèi)瓊脂平板上所生成的細(xì)菌集落數(shù),并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù),計算出每g或ml樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。
四、菌落總數(shù)測定中的一些要求和規(guī)定
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗(yàn)時必須遵循以下一些要求和規(guī)定。
(一)所用器皿及稀釋液
1.檢驗(yàn)中所用玻璃器皿,如培養(yǎng)皿,吸管、試管等必須是完全滅菌的,并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2.用作樣品稀釋的液體,每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個菌落時,要追加對照平板,以判定是空白稀釋液,用于傾注平皿的培養(yǎng)基,還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3.檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水,但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1%蛋白胨水為合適,因蛋白胨水對細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用,不會因?yàn)樵谙♂屵^程中使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)死亡。如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋,則宜采用蒸餾水。
(二)檢樣稀釋
1.檢樣稀釋時,應(yīng)無菌稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或ml)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠),經(jīng)充分振搖作成1:10的稀釋液。
如肉、魚等固體樣品,最好剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻,或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中，以8000-10000rpm速度攪拌1分鐘,使做成均勻的1:10稀釋液。
2.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計,將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1ml與9ml稀釋液混和做成1:100的稀釋液,然后依次遞増稀釋,做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次,必須另換1支1ml滅菌吸管,這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
3.從吸管筒內(nèi)取出滅吸管時,不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時,也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分:因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
4.在作10倍遞増稀釋中,吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時,應(yīng)先高于吸管刻度,然后提起吸管尖端離開液面,將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度,這樣取樣較準(zhǔn)確,而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時不會有多余的液體粘附于管外。
5.當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時,應(yīng)小心沿管壁加入,不要觸及管內(nèi)稀釋液,以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
（三）平板接種與培養(yǎng)
1.將稀釋液加至滅菌平皿時，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液加入皿內(nèi)（從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋），最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應(yīng)做2個平皿。
2.用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45土1℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時,每皿內(nèi)傾入的1.5ml，最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3.為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落,在檢液加入平皿后,應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂,并立即使其與瓊脂混和均勻。
4.檢樣與瓊脂混和時,可將皿底在平面上先向一個方向旋轉(zhuǎn),然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn),以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心,不要使混和物到皿邊的上方。為了保證混和均勻,而不濺及皿邊的上方,可使用自動平皿旋轉(zhuǎn)儀,直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)位上(可同時放4只平皿),加入瓊脂后,開動電鈕,在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動左右旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣與瓊脂混合均勻。
5.皿內(nèi)瓊脂凝固后,不要長久放置,然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng);而應(yīng)于瓊脂凝固后,在數(shù)分鐘內(nèi)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng),這樣可避免菌落蔓延生長。必要時,可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后,再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動性強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長。
6.為了控制污染,在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時,于工作臺上打開一塊瓊脂平板,其暴露的時間,應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴落的最長的時間相當(dāng),然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng),以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。
7.培養(yǎng)溫度,應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng),水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為48±2小時。其他食品,如清涼飲料,調(diào)味品,糖果、糕點(diǎn)、果脯、酒類(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌菜均系用37℃ 24±2小時培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時間之所以有這種不同的區(qū)分,是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時,分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數(shù)據(jù)。水產(chǎn)品因來自淡水或海水,水底溫度較低,因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時,用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
(四)對照試驗(yàn)
1.加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液(特別是10-1的稀釋液),有時帶有食品顆粒,在這種情況下,為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿,不經(jīng)培養(yǎng),而于4℃環(huán)境中放置,以便在計數(shù)檢樣菌落時用作對照。
2.為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已融化而保溫于45℃水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100ml加1ml 0.5%TTC水溶液。培養(yǎng)后，如食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落，配好的TTC溶液，應(yīng)先用來與不加TTC的做對照，以觀察其對計數(shù)是否有不利的作用（TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用）。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏（formazan），使菌落呈現(xiàn)紅色。
（五）菌落計數(shù)
1.從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計數(shù)時,應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗(yàn)的2個平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近,不同稀釋度的幾個平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比,即檢樣稀釋倍數(shù)越大,菌落數(shù)越低,稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
2.計數(shù)菌落時,應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。1個稀釋度使用兩個平板,應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)：如其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù),若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個稀釋度的兩個平板中,一個平板的菌落數(shù)在30-300之間,另一個大于300或小于30時,則以菌落數(shù)在30~300間的平板作為計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。
3.菌落計數(shù)所得結(jié)果,可分別按以下幾種不同情況作報告。
(1)若1個稀釋度的平均菌落數(shù)在30-300之間,則將該菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報告之。
(2）若有兩個稀釋度,其生長的菌落數(shù)均在30~300之間・則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應(yīng)報告其平均數(shù),例如2:46000/29500=1.6＜2,故報告為:(46000+29500)/2=37750或3.8×104。若大于2,則報告其中較小的數(shù)字,如3:6000/27100=2.2＞2，故報告為:27100或2.7×104。若等于2,亦報告其中較小的數(shù)字,如4:3000/1500=2,故報告為:1500或1.5×103。
(3)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之，如報告為:313×108=313000或3.1×105。
(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以選擇的稀釋度。
(5)若所有稀釋度均無菌落生長,則以小于1(＜1)乘以最低稀釋倍數(shù)報告之,如報告為1×10,或＜10。
(6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間,其中一部分大于300或小于30時,則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。
4.注意事項(xiàng)
(1)如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高,則系檢驗(yàn)工作中發(fā)生的差錯,屬實(shí)驗(yàn)室事故。此外,也可能因抑菌劑混入樣品中所致,均不可用作檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。
(2)如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落,菌落之間沒有明顯的界限,這是在瓊脂與檢樣混合時,一個細(xì)菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計,如有來源不同的幾條鏈,每條鏈作為一個菌落計,不要把鏈上生長的各個菌落分開來數(shù)。此外,如皿內(nèi)瓊脂凝固后未及時進(jìn)行培養(yǎng)而遭受昆蟲侵入,在昆蟲爬過的地方也會出現(xiàn)鏈狀菌落,也不應(yīng)分開來數(shù)。
(3)如果所有平板上都有菌落密布,不要用多不可計作報告,而應(yīng)在稀釋度最大的平板上,任意數(shù)其中2cm2個,除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6cm2數(shù),再乘其稀釋倍數(shù)作報告。例如10-1~10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布,而在10-3稀釋的平板上任數(shù)2個cm2內(nèi)的菌落數(shù)是60個,皿底直徑為9cm,則該檢樣每g(或ml)中“估計”菌落數(shù)為:60/2×63.6×1000=19080001.9×106。63.6cm2數(shù)系按皿底直徑為9cm時計算而得,即:(9/2)2×3.14=63.6:如所用平皿的皿底直徑不是9cm,則可按其直徑的實(shí)際cm數(shù)代人圓面積公式求出。
(5)檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料),則平板計數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除,不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告,一般在校正檢樣的pH7.6后,再進(jìn)行稀釋和培養(yǎng),此類嗜酸性微生物往往即不易生長，并可用革蘭氏染色鑒別。染色鑒別時，要用不矯正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所成的菌落涂片染色作對照，用以辨別。酵母菌卵圓形，遠(yuǎn)比細(xì)菌大，大小為2~5×5~30um，革蘭氏陽性著色，乳酸桿菌在24小時內(nèi)，于普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。
（五）報告方式
1、當(dāng)檢樣的菌落數(shù)為1-100時,按實(shí)有數(shù)報告:大于100時,只記錄左面頭兩位數(shù)字(用兩位有效數(shù)字作報告,可避免產(chǎn)生虛假的精確概念)。左面第三位數(shù)字則用四舍五入法計算,從第二位數(shù)字之后都記為0，為了縮短數(shù)字后面的0數(shù),也可用10的指數(shù)來表示,例如菌落數(shù)為37750時,即可寫成3.8×105。
2.檢樣的菌落數(shù)如系從菌落密布的平板上按比例計算而求得,報告結(jié)果時,應(yīng)在菌落數(shù)前加上“估計”二字。
3.檢樣為固體,用重量法取樣檢驗(yàn)時,以g為單位報告其菌落數(shù)；檢樣為液體,用容量法取樣檢驗(yàn)時,以ml為單位報告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液,則應(yīng)以cm2為單位報告其菌落數(shù)。4.如檢樣為液體,在兩個平皿內(nèi)所加1ml未經(jīng)稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中,均無細(xì)菌集落生成,則報告為1ml檢樣內(nèi)未有菌落生長,或1ml檢樣內(nèi)菌落數(shù)＜1。
五、特殊的方法
(一)平板表面涂布法
將營養(yǎng)瓊脂制成平板,經(jīng)50℃ 1-2小時或35℃ 18-20小時干燥后,于其上滴加檢樣稀釋液0.2ml,用L棒涂布于整個平板的表面,放置片刻(約10分鐘),將平板翻轉(zhuǎn),移至36土1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24土2小時(水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)48土2小時),取出,按前述方式進(jìn)行菌落計數(shù),然后乘以5(由0.2ml換算為1ml),再乘以樣品稀釋的倍數(shù),即得每g或ml檢樣所含菌落數(shù)。
此法較上述傾注法為優(yōu),因菌落生長在表面,便于識別和檢查其形態(tài),雖檢樣中帶有食品顆粒也不會發(fā)生混淆,同時還可使細(xì)菌不必遭受融化瓊脂的熱力,不致因此而使菌細(xì)胞受到損傷而不生長,從而可避免由于檢驗(yàn)操作中的不良因素而使檢樣中細(xì)菌菌落數(shù)降低。但是本法取樣量較傾注法為少(僅傾注法的五分之一），代表性將受到一定的影響。
(二)平板表面點(diǎn)滴法與涂布法相似。所不同者,只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴(使每滴相當(dāng)于0.025ml)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域(預(yù)先在平板背面用標(biāo)記筆劃成四個區(qū)域),每個區(qū)域滴1滴,每個稀釋度滴兩個區(qū)域,作為平行試驗(yàn)。滴加后,將平板放平片刻(約5~10分鐘),然后翻轉(zhuǎn)平板,如前移入溫箱內(nèi)培養(yǎng)6~8小時后進(jìn)行計數(shù),將所得菌落數(shù)乘以40(由0.025ml換算為1ml),再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得每g或ml檢樣所含菌落數(shù)。本法具有快速、節(jié)省人力物力，但此法取樣量少，代表性可能受到影響。
