IEF用Biorad的圓盤電泳槽（不行用國產(chǎn)的吧,不推薦）,SDS-PAGE用六一廠的就可以了（ft,六一廠應(yīng)該給我money吧,給你做廣告了）（money不是很多的強(qiáng)烈推薦六一的,買進(jìn)口電泳槽的錢留出來測搞出的差異蛋白質(zhì)的序列吧,呵呵）

    BIO－RAD 的圓盤電泳槽,國產(chǎn)的不推薦,因?yàn)?上槽 Biorad 的鉑金絲凹進(jìn)去了一點(diǎn),不是很進(jìn)去,而國產(chǎn)的凹得太進(jìn)去了以至于電聚焦時產(chǎn)生的氣泡繞在鉑金絲一圈,影響電聚焦.

雙向電泳

1.蛋白質(zhì)樣品制備

    秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal 等（1986）的方法進(jìn)行.100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制,含10mM 即0.07%β- 巰基乙醇）,混勻,-20℃沉淀1 小時,4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巰基乙醇）,再于-20℃沉淀1小時,同上離心棄上清,（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干.

    按每mg干粉加入20μl（可調(diào)）UKS液[9.5 M尿素,5mM 碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT（二硫蘇糖醇）,2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10）,6% Triton X-100],37℃育30min,期間攪動幾次,28度 （溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min,離心力越大時間長一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳.或者-70度保存

2 蛋白質(zhì)濃度測定

    按Garrels（1983）的程序,稍加改動.10μl上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,冰浴30min后,4℃,4000 r/min離心15min,棄上清,再加入100μl冷丙酮,同上離心5min,棄上清,凍干沉淀,用100μl PBS溶液復(fù)溶,并按Bradford（1976）的程序測定蛋白質(zhì)濃度.說實(shí)話,好象Bradford法不太好做

2.3.1 電聚焦（IEF）

2.3.1.1 玻管準(zhǔn)備

    干凈玻管（18cm×1.5mm）用Parafilm封口膜封好底部,在16cm處作好標(biāo)記,垂直放在泡沫板上.電聚焦的管子,買原裝的也可以,實(shí)在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,內(nèi)徑1.5mm左右的,長度取18cm,用玻璃刀做,呵呵,很容易的；玻璃管的處理,先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr,用自來水沖后；用雙蒸水沖,用雙蒸水泡至少1hr,中間至少換2,3 次水；后用2M的HCL 泡至少1 個小時,用雙蒸水沖,（不能用自來水沖）,然后雙蒸水泡至少1 個小時,中間換3,4 次水,可多泡一會.最后泡在無水乙醇里面1hr,轟干就可以用了.

2.3.1.2 凝膠制備與電聚焦

    灌IEF的配方為

    3.09克尿素

    1.125 ml 10%NP-40

    1.125ml 水

    0.735ml 30%屏息現(xiàn)案 （ACR 28.38 BIS 1.62）

    0.15 ml Am 3.5-10

    0.375ml Am 5-7

    8微升 10%AP

    1.8微升TEMED

    用注射器吸好膠液,裝上7號針頭,將7號針頭插入玻管底部,邊推注射器邊提針頭,直到標(biāo)記處,用微量進(jìn)樣器小心加入少量水,可見明顯的界面出現(xiàn),讓其聚合1小時以上,適當(dāng)長一點(diǎn)的時間好一些,我一般是頭天下午灌膠,第2 天下午才開始跑電泳.待膠聚合好后,除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液,加樣80μg,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破壞樣品與NaOH 的界面.即可進(jìn)行電泳.電極液為：上槽（負(fù)極）為50m mol/L NaOH 液,下槽（正極）為25m mol/L H3PO4.按 200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序進(jìn)行電聚焦.或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特別是冬天,我的方法是 溫控儀控制 暖風(fēng)機(jī) 在37 度暖風(fēng)機(jī)和電泳槽在一個大的紙箱（密封）里.呵呵,應(yīng)該可以想象得到吧,第一向溫度特別重要,不然,電聚焦肯定做不好.

2.3.1.3 電泳后的凝條處理

    電聚焦完畢后,用注射器吸滿水,套上一個200μl的槍頭,當(dāng)然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣.從頂部向下注水使膠條向下滑出.當(dāng)然,剛開始做的時候肯定不熟,很不爽,有時候你會唱 想哭卻又哭不出來,呵呵,熟悉了就快了,注射器 槍頭玻璃管必須為一直線,消息不要把注射器的頭搞斷了.取一膠條,用雙蒸水洗凈兩端,按酸端到堿端的順序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過夜,次日用酸度計分別測定各段的pH值,以凝膠長度為橫坐標(biāo),pH值為縱坐標(biāo)作圖,即為等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線.漫漫擠,管子,200 衛(wèi)生槍頭,注射器,要成一直線,,要用一手扶著管子,一手拿住200 衛(wèi)生槍頭,保證水不從槍頭和管子處流出來,注射器頂在胸前把膠條擠出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,想什么時候跑SDS-PAGE就什么時候跑.絕招哦,不要隨便亂傳,嘿嘿！還可以馬上看一下,膠條上有蛋白質(zhì)沒有,有的話一下就可以看見了.那些說什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF 膠條一樣的,帶,可能先在12%的TCA 里面看不見,不過你再把它放在水里面,泡一會帶就出來了.不過在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要換至少5 次水,每次用不同的小平皿.

    注意到下級液 磷酸 部分的膠條沒,是不是有一節(jié)約2cm左右,比較突出,沒有膨大的部分呀！只是在tca泡的時候磷酸段有一小截變白的速度比較慢,大約3cm左右,呵呵！

    對要進(jìn)行第二向SDS-PAGE 的膠條則必須用平衡液[2.3%SDS,62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8）,10%甘油,5%β－巰基乙醇,0.1%溴酚藍(lán)]進(jìn)行二次平衡,第一次20min,第二次25min.第2 次的溶液為新的.一般我是把第2次用過的當(dāng)成第一次的用 .平衡過程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿.

2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

    選用DYY-Ⅲ型（北京六一儀器廠生產(chǎn)）電泳槽（規(guī)格為200×200×1mm）,分離膠濃度為12%,無濃縮膠.待膠聚合后,將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端（避免膠條拉直）,并用1%瓊脂糖（電極緩沖液配制）封膠,特別應(yīng)注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮.61 廠板子之灌膠：堅決不用凡士林,用透明膠將兩端（板子的2 邊）封住,再用2%瓊脂之SDS-PAGE 電極液封底,待瓊脂凝固后再灌膠,最后用水封膠.over！

    做之前,一定要保證,1,灌膠不會有任何問題,不能漏,2,不用濃縮膠,只用分離膠.3,分離膠用水封,要保證凝聚好的PAGE 膠,為一平的線,凹來凸去的就不要用了.玻璃版能用硅化劑最好不過了.防止從邊上漏,我用透明膠（約4cm寬）,封住兩邊,下面還是用2%的瓊脂封.灌好電極緩沖液[25m mol/LTris,192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS],按25mA/板膠恒流進(jìn)行電泳,待溴酚蘭離底部1cm時即可停止電泳,一般電泳耗時約4-5h.銀染：凝膠于40%甲醇,10%醋酸中固定1h以上或者過夜；用水洗1次,5min；30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸鈉1min；水洗3×20s；0.2%硝酸銀,0.02%甲醛快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進(jìn)去,馬上又倒掉；0.2%硝酸銀,0.02%甲醛20min；水洗3×20s；顯色液（3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉）快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進(jìn)去,馬上又倒掉；顯色液（3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉）顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點(diǎn)又多的話就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停顯.染色理想溫度：我去年4,5月時,通常染色都定在中午,12點(diǎn)多；溫度最好是20 度左右,（這個溫度我也沒控制的）100%TCA領(lǐng)一瓶TCA 500g的那種 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA,0.07%2-ME 丙酮 （100ml）：

    100%TCA 10ml

    2-ME 0.07ml

    丙酮 90ml

    0.07%2-ME 丙酮 （100ml）：

    2-ME 0.07ml

    丙酮 100ml

    0 Farrel 液（9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME）50ml

    Urea 28.5g

    NP-40 1ml

    Ampholine 5~7 2.0ml

    3.5~10 0.5ml

    2-ME 2.5ml

    注意定容！配好后用1.5ml 管分裝！-70度保存

    注意 這兩個溶液 配的時候 比如配 50ml 用100ml的燒杯 用量筒量50ml 水 倒如燒杯里面,用記號筆標(biāo)上刻度,然后把水倒掉,再稱 尿素 小量加水,因?yàn)槟蛩丶铀�后體積會變大,再37 度水域鍋里溶,然后加其它成分,最后再定到50ml

    UKS液 （含9.5M Urea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine（3.5~10）,6%Triton X-100）

     25ml 50ml

Urea 14.25g 28.5g

K2CO3 17.25mg 34.5mg

SDS 0.3125g 0.625g

DTT 0.125g 0.25g

    2-ME

    Ampholine（3.5~10）1.25ml 2.5ml

    Triton X-100 1.5ml 3ml（0.86ml 2 槍,4槍）

    2-ME 可適當(dāng)加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分裝！-70度保存！

雙向電泳IPG（summer）

一、樣品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法

（1）在液氮中研磨葉片

（2）加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心（4℃8000rpm以上1 小時）棄上清.

（3）加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）,搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時）,然后真空干燥沉淀,備用.

（4）上樣前加入裂解液,室溫放置30 分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心（15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)）,可臨時保存在4℃待用.

（5）用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?

二、一向電泳（13cm的holder）

（1）取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達(dá)到250vl

（2）將上述溶液加到holder 的兩個電極之間.

（3）去掉膠條的保護(hù)膜,膠面朝下,先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,慢慢下壓膠條,并前后移動,避免生成氣泡,最后放下膠條平端,使溶液浸濕整個膠條.

（4）在膠條上覆蓋適量的覆蓋油,蓋上蓋子.

（5）將膠條槽平放于一向儀器上,與水平方向垂直.

（6）設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù)：

三、膠條的平衡（由一向到二向）

（1）將膠條放入10ml 平衡緩沖液中（加入10mgDTT）封口,在振蕩儀上振蕩15 分鐘.

（2）將膠條取出放入10ml 新的平衡緩沖液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口,在振蕩儀上振蕩15 分鐘.

（3）用去離子水潤洗膠條一秒鐘,將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘,以去除多余的平衡緩沖液.

四、二向電泳

（1）將平衡好的膠條直接轉(zhuǎn)移到第二向制好的SDS膠上,然后用瓊脂糖封頂,準(zhǔn)備第二向電泳.

（2）設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù)：

 

五、平板膠的染色

    硝酸銀染色：（整個操作在搖床上進(jìn)行）

（1）固定：25ml的冰醋酸,100ml甲醇,125ml 去離子水,60 分鐘.

（2）敏化：75ml甲醇,0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入）,17g醋酸鈉,165ml去離子水,30分鐘.

（3）清洗：用250ml 的去離子水清洗3 次每次5 分鐘.

（4）銀染：0.625g硝酸銀,250去離子水,（使用之前配制）20 分鐘.

（5）顯色：6.25g碳酸鈉,100vl 的甲醛（使用之前加入）,250ml 去離子水.

（6）終止：5%的醋酸.

（7）照相分析.

（8）保存制作干膠.

藥品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中（終體積為5ml）,使用前再加入1M 的DTT65μl/ml.

平衡緩沖液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml,尿素72.07g ,87%的甘油69ml,SDS 4g,溴酚藍(lán)少許.溶漲液：尿素12g,CHAPS0.5g,溴酚藍(lán)少許溶于無菌水中,總體積為25ml.使用之前再加入IPG緩沖液 0.5vl/100vl,DTT1.5vl/100vl.

制作平板膠：

分離膠的配制方法：

    藥品/濃度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%

    丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml

    分離膠緩沖液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

    10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml

    無菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml

    10%過硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl

    TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl

    *在灌膠之前加入 

藥品配制：

    丙烯酰胺單體儲液：丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無菌水中總體積200ml分離膠緩沖液：Trisbase181.5g 溶于750ml 無菌水中調(diào)pH8.8總體積1000ml10%SDS：SDS5g溶于無菌水中總體積50ml10%的過硫酸胺：0.1g溶于無菌水中總體積1mlSDS 電泳緩沖液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于無菌水中總體積5000ml

    封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml 瓊脂糖0.5g溴酚藍(lán)少許附：蛋白質(zhì)含量測定的方法（Bradford 方法）

原理：這一方法基于2 考馬斯亮藍(lán)G－250 有紅藍(lán)兩種不同的形式.在一定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,產(chǎn)生藍(lán)色化合物,反應(yīng)迅速而穩(wěn)定.反應(yīng)化合物在 465－595nm處有最大的光吸收值,化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系,因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量.

   溶液：

1）Bradford儲存液

    100ml95%乙醇

    200ml88%磷酸

    350mgServaG藍(lán)

    室溫下長期保持穩(wěn)定.

2）Bradford工作液

    425ml雙蒸水

    15ml95%乙醇

    30ml88%磷酸

    30ml Bradford儲存液

    用濾紙過濾,保存于室溫棕色瓶中,可保存數(shù)周,但在使用前需要過濾.

3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）

    做標(biāo)準(zhǔn)曲線：取樣品即可測量.

    注意事項：

1、樣品的問題：

    樣品制備是做好2-d 的關(guān)鍵,這句話好象有點(diǎn)多余,如果樣品中離子濃度過大,根本做不了2d,我開始的時候由于提取方法有問題,結(jié)果浪費(fèi)了很多時間和IPG膠條,真的很心痛呀！另外再說明一點(diǎn),最好用新鮮的樣品提取蛋白質(zhì),蛋白點(diǎn)的差異很大,新鮮的樣品點(diǎn)多,而我用存放在-80 的樣品跑出來效果差了很多呀！如果你不確定你的蛋白提的如何,建議你先跑sds-page.檢驗(yàn)一下.關(guān)于蛋白的提取方法,我還想聽聽各位的建議.

2、上樣量的問題,我覺得我跑的這張2D 圖,上樣量還需要調(diào)整,可以適當(dāng)降低,我的ipg 膠條是13 厘米的上樣量在50ng-80ng之間,上樣量不合適,豐度低的將會被豐度高的所遮蓋,這是最討厭的問題.

3、跑一向的時候大家都差不多,根據(jù)公司的說明就可以做了.跑二向的時候我現(xiàn)在一般做恒壓,以前做過恒流,沒感覺有什么差異,還想請教各位！橫流和恒壓到底哪個更好一些！

4、ipg 膠條ph 的選擇,我做的是植物的花藥,一般情況下酸性端點(diǎn)多一點(diǎn),堿性端較少,我現(xiàn)在選用的是ph3-10 的,我覺得很不合適,（不過這個膠條是免費(fèi)的）因此好多點(diǎn)沒能很好的分開,如果膠條的ph小一點(diǎn),膠條（我希望能達(dá)到18cm）可是我們這里做不了,效果應(yīng)該比這個好很多的！

5、從這塊膠上,我覺得致命點(diǎn)就是背景深,將影響我下一步的分析.所以銀染還需要改進(jìn)！

6、針對不同的蛋白質(zhì),分離膠的濃度也是可以調(diào)節(jié)的,我比較懶,就作過10%,12.5%的,不過覺得都不適合.