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      微生物實(shí)驗(yàn)室的菌種鑒定小結(jié)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2021-10-28
      核心提示:微生物檢驗(yàn)過程中檢出的微生物應(yīng)該進(jìn)行微生物鑒定,雖然藥典里明確了鑒定到什么水平的標(biāo)準(zhǔn)和一些基礎(chǔ)內(nèi)容操作方法。但是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)
       微生物檢驗(yàn)過程中檢出的微生物應(yīng)該進(jìn)行微生物鑒定,雖然藥典里明確了鑒定到什么水平的標(biāo)準(zhǔn)和一些基礎(chǔ)內(nèi)容操作方法。但是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室能力有限,很多實(shí)驗(yàn)室要么消極抵抗要么稀里糊涂的。

       

      其實(shí)我們一般微生物實(shí)驗(yàn)室自己還是可以做一些工作,特別是細(xì)菌的鑒定。再就是菌種鑒定時,不是直接拿來就鑒定,需要一些預(yù)先做一些處理或判斷。現(xiàn)將一些基礎(chǔ)知識進(jìn)行總結(jié)如下:

       

      一、相關(guān)定義

       

      1、生理生化鑒定:根據(jù)微生物對各種生理?xiàng)l件(溫度、pH、氧氣、滲透壓)、生化指標(biāo)(唯一碳氮源、抗生素、酶、鹽堿性)代謝反應(yīng)進(jìn)行分析,并將結(jié)果轉(zhuǎn)化成軟件可以識別的數(shù)據(jù),進(jìn)行聚類分析,與已知的參比菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,最終對未知菌進(jìn)行鑒定的一種技術(shù)。

       

      2、革蘭氏染色:系細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,而用以分類鑒定。

       

      3、平板劃線法:系指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

       

      4、氧化酶試驗(yàn):氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應(yīng),而是先使細(xì)胞色素C氧化,然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)而進(jìn)行的試驗(yàn),用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌(氧化酶陽性)和腸道菌(氧化酶陰性)。

       

      5、觸酶試驗(yàn):大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶,但鏈球菌屬陰性,故常用此試驗(yàn)來鑒定,用于區(qū)分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性)和鏈球菌(過氧化氫酶陰性)。

       

      6、凝固酶試驗(yàn):用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌(可推測為非致病性)和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性)。

       

      二、工作程序

       

      1、微生物鑒定程序

       

      微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定,鑒定時一般先將待檢菌進(jìn)行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定,根據(jù)所需要達(dá)到的鑒定水平選擇鑒定方法。目前實(shí)驗(yàn)室室進(jìn)行表型微生物鑒定后可以用API試劑條進(jìn)行或其他等效的試劑條進(jìn)行菌種鑒定,如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。

       

      注:為了控制成本,可以自己進(jìn)行鑒定,不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限,需要注意效期或跟供應(yīng)商做好溝通備貨。

       

      1.1 待檢菌的分離與純化

       

      微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化,最常用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養(yǎng)物(單個菌落),必要時可進(jìn)一步進(jìn)行純培養(yǎng),為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的樣品中檢出的受損微生物,經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)變?yōu)樵跔I養(yǎng)富集和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài),以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,具體詳見表1。

       

      表1待檢菌的分離與純化明細(xì)表

      圖片

       

      1.1.1 平板劃線法

       

      平板劃線方法一般通過連續(xù)畫蛇形曲線或四區(qū)劃線方法進(jìn)行。四區(qū)劃線具體步驟如下:先在平皿上做好標(biāo)識,然后在選擇所獲得的新鮮菌種進(jìn)行劃線;左手持無菌平板,拇指和食指控制皿蓋,其余指控制皿底,打開皿蓋,用接種環(huán)在皿上進(jìn)行劃線,一區(qū)要連續(xù)緊密的幾根平行線(如果菌量過多可以更換接種環(huán)),二區(qū)緊著著一區(qū)的最后一根線帶出來,劃幾根平行線,然后三區(qū)、四區(qū)同樣的操作,四區(qū)應(yīng)盡量避免接觸到菌落密集區(qū),影響單菌落的形成;最后再選擇適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

       

       

       

      1.1.2 稀釋倒平板法

       

      首先把微生物懸液作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分別取不同稀釋液少許,與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合,搖勻后,傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中,待瓊脂凝固后,制成可能含菌的瓊脂平板,保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。

       

      如果稀釋得當(dāng),在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落,這個菌落可能就是由一個細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落,或重復(fù)以上操作數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)。

       

      1.1.3 涂布平板法

       

      因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡,且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長,因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

       

      其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿,制成無菌平板,冷卻凝固后,將一定量的微生物懸液滴加在平板表面,再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面,經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。

       

       

      1.2 初篩實(shí)驗(yàn)

       

      常規(guī)的微生物鑒定,一般要先進(jìn)行初篩試驗(yàn)確定待檢菌的基本微生物特征,將待檢菌進(jìn)行初步分類。常見的初篩試驗(yàn)包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。

       

      1.2.1 革蘭氏染色

       

      原理:檢查細(xì)菌細(xì)胞壁的滲透性,染色前所有細(xì)胞是透明的,結(jié)晶紫著色后用碘增加染料與菌體結(jié)合,乙醇從G(-)菌體洗脫結(jié)晶紫,用番紅液復(fù)染,革蘭氏陰性菌呈粉紅色,革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色。

       

      染色步驟:一般按照染色液說明書規(guī)定進(jìn)行染色,如說明書無明確說明時按以下步驟進(jìn)行染色。結(jié)晶紫初染,在載玻片上滴一小滴純化水,用灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開,涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1cm的薄層。

       

      將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺過燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次,再冷卻,重復(fù)操作直到薄層干燥為止;在制好的片上滴一滴草酸銨結(jié)晶紫,染色1min后用水洗;碘液媒染,加碘液一滴,作用1min后用水沖洗,用過濾紙吸干;乙醇脫色,用95%乙醇脫色,脫色時間大概為30s。水洗后用過濾紙吸干;番紅復(fù)染,滴加0.5%的番紅染色液一滴,染色10~30s后,用自來水沖洗。

       

      鏡檢:先低倍鏡,再高倍鏡,最后油鏡觀察,觀察菌落形態(tài)與菌落顏色,菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌,呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌。

       

      1.2.2 芽孢染色

       

      一般按照染色液使用說明進(jìn)行芽孢染色。如無明確說明時按以下步驟進(jìn)行芽孢染色。涂片,先在載玻片上滴一滴純化水,用接種環(huán)灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開,涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1cm的薄層。

       

      干燥固定,將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺過燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次,再冷卻,重復(fù)操作直到薄層干燥為止?兹妇G覆蓋,用木夾夾住載玻片一端,加數(shù)滴5%孔雀綠染液覆蓋涂片,在微火上加熱至染料冒蒸汽并開始計(jì)時,維持5min。

       

      沖洗,待玻片冷卻后,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止。復(fù)染,用0.5%番紅染液覆蓋玻片,保持3min。水洗干燥,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止,使其自然干燥。鏡檢,觀察菌落是否含有芽孢。

       

      1.2.3 氧化酶試驗(yàn)(革蘭氏陰性桿菌)

       

      革蘭氏陰性菌,做氧化酶試驗(yàn)。取將待檢菌落于無菌的濾紙片上,滴加一滴氧化酶試劑,反應(yīng)3分鐘,出現(xiàn)紫色為陽性,反之為陰性。

       

      1.2.4 非發(fā)酵菌鑒定

       

      接種前把OF培養(yǎng)基在沸水浴溶解,在室溫冷卻后,每試驗(yàn)分裝2個安培的固體OF培養(yǎng)基,利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養(yǎng)基(深度約1cm),把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養(yǎng)35-37°C , 24–48小時。

       

      結(jié)果判定:兩瓶均為黃色,則為發(fā)酵菌,則為發(fā)酵菌,兩管培養(yǎng)基一瓶顯示綠色F-,一瓶顯示黃色O+。

       

      1.2.5 觸酶試驗(yàn)(革蘭氏陽性菌)

       

      玻片法:挑取被撿菌落于玻片上,直接用試劑進(jìn)行乳化,5s內(nèi)產(chǎn)生氣泡即為陽性結(jié)果,反之為陰性。

       

      1.3 表型微生物鑒定

       

      表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來區(qū)分不同微生物間的差異,是經(jīng)典的微生物分類鑒定法,以微生物細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性表型為主要指標(biāo),通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進(jìn)行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

       

      表2 微生物分類中使用的表性特征表

       

      1.4 API試劑條的使用

       

      1.4.1 API試劑條的選條標(biāo)準(zhǔn)

       

      根據(jù)API系統(tǒng)選條標(biāo)準(zhǔn),來選擇適合的API鑒別條來鑒別。如革蘭氏陽性球菌:觸酶試驗(yàn)陽性為葡萄球菌用API STAPH鑒別,觸酶試驗(yàn)陰性為鏈球菌用API 20 STREP鑒別。

       

      1.4.2 API試劑條的操作步驟

       

      1.4.2.1 分離單個菌落:用一次性無菌接種環(huán)或已滅菌棉簽挑單個可疑菌落,盡量避免使用高度選擇性培養(yǎng)基。

       

      1.4.2.2 安瓿瓶的開啟:蓋上安瓿開啟器,用手垂直握住安瓿瓶(白色塑料瓶蓋朝上),盡量將瓶蓋壓下,用大拇指頂住瓶蓋上斜面部分,同時用拇指向外加壓。

       

      1.4.2.3 制菌懸液:將挑取的單個菌落置于含0.85%氯化鈉溶液或懸浮培養(yǎng)基5ml的安培瓶,混勻。

       

      1.4.2.4 測定菌懸液濁度

       

      1.4.2.4.1 菌液的加入:將5mL無菌水放入培養(yǎng)盒以提供濕潤的培養(yǎng)環(huán)境,同時放入試紙條,將菌液接種到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL),利用石臘油覆蓋指定的生化孔(有劃線的孔ADH,ODC,H2S 和URE),蓋上培養(yǎng)蓋。

       

      1.4.2.4.2 培養(yǎng):把試紙條放進(jìn)培養(yǎng)箱內(nèi),利用指定溫度及時間進(jìn)行培養(yǎng)(如API20E : 35~37℃,18-24小時)。

       

      1.4.2.4.3 附加試劑加入:培養(yǎng)結(jié)束后,按操作說明書規(guī)定,將附加試劑加進(jìn)適當(dāng)小孔內(nèi)。

       

      1.4.2.4.4 結(jié)果分析:登錄APIWEB,試紙條上每三個小孔(小管)作為一組,記分分別為1、2、4分,將試紙條的顯色情況進(jìn)行輸入,進(jìn)行結(jié)果對比判讀。

       

      1.4.2.5 結(jié)果判讀原理

       

      生化結(jié)果組合跟資料庫內(nèi)的典型條目(Taxa)作出比較,經(jīng)計(jì)算後,鑒定百比率(%Id)=機(jī)會率,指示出不同菌類的比較,T值指示出在同一個菌類的相似程度。依據(jù)T值及%Id的組合,作出評語:

       

      極好的鑒定結(jié)果          %Id >99.9及T>0.75  
      很好的鑒定結(jié)果          %Id >99.0及T>0.50  
      好的鑒定結(jié)果              %Id >90.0及T>0.25  
      可以接受的鑒定結(jié)果   %Id >80.0及T>0  
      可疑的生化譜              N/A

      編輯:songjiajie2010

       
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