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通過驗(yàn)證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測(cè)定，方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。如下人員對(duì)方案負(fù)責(zé)：
方案具體內(nèi)容如下： 根據(jù)樣品特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。通過驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定；確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。
一、細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證 建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。
1.1.驗(yàn)證用菌株及菌種要求
上述菌株作為霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株。 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。
1.2.驗(yàn)證菌菌液制備
1.3. 供試液的制備 無抑菌活性的供試品供試液的制備：
具有抑菌活性的供試品供試液的制備（當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，須先消除抑菌活性），其方法如下：
1.4. 菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。 采用平皿法，取試驗(yàn)用的1mL菌液（約50～100CFU）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。
1.5.試驗(yàn)組
1.6. 供試品對(duì)照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗(yàn)組相同）。 1.7.稀釋劑對(duì)照組 若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終濃度為每1mL 供試液含50～100CFU，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)。 1.8.回收率計(jì)算 試驗(yàn)組回收率計(jì)算：試驗(yàn)組的菌回收率＝ 試驗(yàn)組的菌回收率—供試品對(duì)照組平均菌落數(shù) ×100%菌液組的平均菌落數(shù) 稀釋劑對(duì)照組回收率計(jì)算：試驗(yàn)組的菌回收率＝ 稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù) ×100%菌液組的平均菌落數(shù) 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。 結(jié)果判斷： 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證，使試驗(yàn)組菌回收率大于70%。
項(xiàng)目責(zé)任人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草及具體實(shí)施。 驗(yàn)證管理員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。 QA現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證實(shí)施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。 QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案中檢驗(yàn)方法的審核及按照規(guī)定的取樣計(jì)劃對(duì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負(fù)責(zé)組織實(shí)施。 QC檢驗(yàn)員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草與參與實(shí)施，并對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。 質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的審核和批準(zhǔn)。
大腸埃希菌【CMCC（B）44102】大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌， 金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌， 枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌， 上述菌株作為細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株； 黑曲霉【CMCC（F）98003】黑曲霉為霉菌， 白色念珠菌【CMCC（F）98001】白色念珠菌為酵母菌，
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大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：
接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃ 培養(yǎng)18～24小時(shí)。取此培養(yǎng)液1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1mL含菌數(shù) 50～100CFU的菌懸液。
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白色念珠菌菌液制備：
接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng) 24～48小時(shí)；取此培養(yǎng)液1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1mL含菌數(shù) 50～100CFU的菌懸液。 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1mL含孢子數(shù)50～100CFU的孢子懸液。
稀釋劑： pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 液體供試品 ：供試品10mL置錐形瓶中，加入90mL稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。 固體、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100mL，混勻后，作為供試液（1：10）。
培養(yǎng)基稀釋法 ：取供試液2mL，每0.2mL的供試液注一皿或每0.1mL的供試液注一皿；或取供試液1mL每0.5mL的供試液注一皿，傾注15mL的培養(yǎng)基，測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1mL供試液所注的平皿生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1mL的菌落數(shù)。計(jì)算每1mL供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)可加大增菌液的用量。 離心沉淀集菌法： 取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。 薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測(cè)定其菌落數(shù)。 -
中和法： 選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶?duì)氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測(cè)定。
平皿法：
取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1mL供試液和50～100CFU試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。 培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）： 取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1mL供試液分別注入N個(gè)平皿中，每個(gè)平皿再注入50～100CFU試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。 薄膜過濾法： 取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100CFU試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定其菌落數(shù)。至少要一張膜。 -
離心沉淀集菌法 ：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1mL液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1mL液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計(jì)數(shù)。
