設(shè)計(jì)空白對(duì)照
（1）檢驗(yàn)過程中需要做空白對(duì)照，用來判斷培養(yǎng)基、稀釋液、平皿或吸管是否存在污染，完美的空白試驗(yàn)平板上應(yīng)該無細(xì)菌生長。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求
（2）定期檢測空氣潔凈度，判斷實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求。
滅菌處理
（3）細(xì)菌檢測過程中所用到的一切用具和培養(yǎng)基都需經(jīng)過滅菌程序。
樣品消毒
（1）任何樣品在打開包裝前，都要在取樣開口處的周圍表面進(jìn)行消毒。
（2）采樣時(shí)對(duì)于易堵塞吸管的樣品（如糕點(diǎn)面包辣條等），可以放置一塊無菌紗布在放樣液的容器瓶口下方，作過濾用。
稀釋度選擇
樣品的稀釋是菌落計(jì)數(shù)的關(guān)鍵步驟之一。對(duì)于固體或半固體樣品，通常需要將樣品均質(zhì)化后進(jìn)行系列稀釋。建議使用無菌的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，并確保每次稀釋后的樣品均勻混合。對(duì)于液體樣品，可以直接進(jìn)行稀釋，但同樣需要注意混合均勻性。選擇合適的稀釋度非常重要，一般建議選擇2-3個(gè)適宜的稀釋度進(jìn)行檢測，以確保最終的菌落數(shù)在可計(jì)數(shù)范圍內(nèi)（30-300 CFU）。
參考值
參考值可能是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)累積的估算數(shù)，也可能是樣品本身標(biāo)注的活菌數(shù)值。對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的操作者而言，即使沒有明確的參考值，也能憑借經(jīng)驗(yàn)準(zhǔn)確進(jìn)行稀釋操作。然而，對(duì)于新手來說，缺乏參考值的情況下可能會(huì)感到迷茫。在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，首先盡可能獲取參考值。根據(jù)參考值，可以選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，然后將適量的樣品與適量的培養(yǎng)基混合，并進(jìn)行均勻涂布。如此一來，可以保證每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)量在合適的范圍內(nèi)，從而得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
擴(kuò)大計(jì)數(shù)范圍
選擇合適的稀釋倍數(shù)和擴(kuò)大計(jì)數(shù)范圍是至關(guān)重要的。一種常見的策略是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或參考值將樣品稀釋到一定倍數(shù)，然后在不同梯度上進(jìn)行涂布。例如，稀釋到10^-8的樣品可以選擇不同梯度的平板進(jìn)行涂布，比如10^-8、10^-7、10^-6各三個(gè)平板。同時(shí)，也可以選擇其他梯度如10^-9、10^-5、10^-4各一個(gè)平板，并留出一個(gè)對(duì)照平板。不同的食品其「菌落總數(shù)」的檢出限量也不一致，通常糕點(diǎn)類樣品中細(xì)菌量偏低，稀釋度應(yīng)選擇較小的，稀釋度可選1:10 。
其次，培養(yǎng)基的選擇和準(zhǔn)備也是影響菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的重要因素。平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）是常用的培養(yǎng)基之一，其滅菌條件為121℃、15分鐘。在傾注培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)確保培養(yǎng)基溫度適宜（約46℃），以避免高溫對(duì)微生物的殺傷作用。此外，對(duì)于一些特殊樣品，可以在培養(yǎng)基中加入適量的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），以便在培養(yǎng)后將菌落染色，方便計(jì)數(shù)。
平板倒置培養(yǎng)，可以減少培養(yǎng)基中水分的蒸發(fā)影響細(xì)菌生長，又可以防止凝結(jié)在皿蓋上的水蒸氣流到培養(yǎng)基表面導(dǎo)致染菌出現(xiàn)菌落蔓延及難以計(jì)數(shù)。菌落蔓延主要有兩個(gè)原因，一是操作不當(dāng)；二是樣品中含有變形桿菌等運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的細(xì)菌。
操作中需要注意3個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：
（1）傾注培養(yǎng)基時(shí)搖晃平皿使其混合均勻，減少菌塊；
（2）樣品稀釋后，盡快傾注平板。從稀釋到傾注結(jié)束時(shí)間控制在30分鐘之內(nèi)，避免樣液干涸造成菌落成團(tuán)；平板凝固后馬上倒置；
（3）若樣品中含有變形桿菌，則可以覆蓋一層培養(yǎng)基（約4mL）。
異�，F(xiàn)象平板如何進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)？
在完成培養(yǎng)后應(yīng)立即進(jìn)行計(jì)數(shù)，通常選取30-300CFU菌落數(shù)、無蔓延菌落生長的平板作為計(jì)數(shù)，但實(shí)際操作中會(huì)出現(xiàn)各種異�，F(xiàn)象。
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現(xiàn)象
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計(jì)數(shù)方式
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無任何明顯界限的鏈狀菌落
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作為一個(gè)菌落
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有幾條不同來源的鏈
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每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算
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片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻
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半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表整塊平板的菌落數(shù)
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