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菌落計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡稱MPN法），其中平皿法可分為傾注平皿法和涂布平皿法，常見的菌落總數(shù)操作方法見表1。
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測試標(biāo)準(zhǔn) |
適用范圍 |
操作方法 |
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GB4789.2-2022 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》 |
食品 |
傾注平皿法/菌落總數(shù)測試片 |
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FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
食品 |
傾注平皿法/螺旋板法 |
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GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》 |
飼料 |
傾注平皿法 |
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GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測定》 |
游泳池水 |
傾注平皿法 |
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GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 |
飲用水/水源水 |
傾注平皿法/酶底物法 |
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WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 |
環(huán)境 |
六級篩孔撞擊式微生物采樣器 |
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GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 |
一次性衛(wèi)生用品 |
傾注平皿法 |
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《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 |
化妝品 |
傾注平皿法 |
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BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
化妝品 |
平皿法/膜過濾法 |
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USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
藥品 |
平皿法/薄膜過濾法/MPN法 |
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BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
根據(jù)上表的適用范圍和操作方法可得出，平皿法是使用范圍最廣。
根據(jù)測試標(biāo)準(zhǔn)適用范圍和樣品特性：
A.平皿法因可操作性性強(qiáng)，會更多用于污染度高的被檢樣品；
B.薄膜過濾法適用于測試量需求大且污染度一般的液體樣品；
C.MPN法可用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差時(shí)，包括對于某些微生物污染度很小的樣品。
故在日常測試中，可根據(jù)樣品的污染度情況去選擇更合適的菌落總數(shù)測試操作方法。
樣品的取樣量與其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或測試方法去選擇，對于官方標(biāo)準(zhǔn)未明確取樣量的，亦可根據(jù)結(jié)果的代表性加大取樣量。稀釋緩沖液的選擇則是要求樣品在稀釋緩沖液中能夠充分混合，從而保證樣品的均一性，故不同樣品，會有不同的稀釋液需求。日常工作中，常見的稀釋緩沖液與要求見表2。
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測試標(biāo)準(zhǔn) |
樣品量 |
稀釋液 |
備注 |
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GB4789.2-2022 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》 |
25g/mL |
無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 |
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FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
50g/mL |
磷酸鹽緩沖液/無菌水 |
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GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》 |
25g/10g |
0.85%生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 |
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GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測定》 |
原液 |
無菌生理鹽水 |
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GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 |
原液 |
無菌生理鹽水 |
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WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 |
28.3L/min，（5-15）min |
不適用 |
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GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 |
10±1g |
無菌生理鹽水（200mL） |
不進(jìn)行梯度稀釋，做5平行 |
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《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 |
10g/mL |
無菌生理鹽水 |
無法充分溶解稀釋液中的樣品可加吐溫80和/或石蠟 |
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BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
1:10（樣品：加稀釋液后） |
無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等
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最終的取樣量與稀釋液，需通過樣品方法學(xué)適用性驗(yàn)證方能使用。 |
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USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
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BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
菌落總數(shù)的培養(yǎng)條件會因不同的樣品類型或制定機(jī)構(gòu)而有所差異，其差異包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的選擇。菌落總數(shù)常見的培養(yǎng)條件見表3。
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測試標(biāo)準(zhǔn) |
培養(yǎng)基 |
培養(yǎng)溫度 |
培養(yǎng)時(shí)間 |
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GB4789.2-2022 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》 |
平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） |
36±1℃（水產(chǎn)品30±1℃） |
48±2h（水產(chǎn)品72±3h） |
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FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
35±1℃（牛奶32±1℃） |
48±2h |
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GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》 |
營養(yǎng)瓊脂（NA） |
30±1℃ |
72±3h |
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GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測定》 |
36±1℃ |
48h |
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GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 |
36±1℃ |
48±2h |
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WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 |
35~37℃ |
48h |
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GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 |
35±2℃ |
48h后 |
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《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 |
卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)瓊脂 （LTNA） |
36±1℃ |
48±2h |
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BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA） |
32.5±2.5oC
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72±6h |
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USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
3~5天 |
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BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
菌落總數(shù)在進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU/cfu，Colony Forming Units）進(jìn)行報(bào)告。在計(jì)數(shù)時(shí)，首先需明確計(jì)數(shù)范圍是否符合要求，從而保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，不同的測試方法在首選計(jì)數(shù)范圍會有一定差異，以及顯色劑在觀察中的應(yīng)用也有一定的要求。詳情見表4。
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測試標(biāo)準(zhǔn) |
培養(yǎng)基中是否可加顯色劑1 |
首選計(jì)數(shù)范圍 |
最終結(jié)果報(bào)告 |
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GB4789.2-2022 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》 |
是 |
30~300cfu |
100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2，采用“四舍五入”。 |
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FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
否 |
25~250cfu |
＜25cfu則報(bào)告＜25或?qū)嶋H值，＞250cfu則報(bào)告＞250或TNTC2。 |
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GB/T13093-2006 《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》 |
否 |
30~300cfu |
100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
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GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗(yàn)方法 細(xì)菌總數(shù)測定》 |
否 |
30~300cfu |
100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
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GB/T5750.12—2023《生化飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》 |
否 |
30~300cfu |
100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
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WS 394-2012 《公共場所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄D 集中空調(diào)送風(fēng)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法》 |
否 |
無 |
報(bào)告cfu/m3 |
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GB15979-2002 《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 附錄B2》 |
否 |
無 |
全部無生長報(bào)＜4cfu/g（mL），若生長，報(bào)100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字。 |
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《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版 |
是 |
30~300cfu |
100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字，＞300cfu的則報(bào)告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
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BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
否 |
平皿法：30~300cfu；薄膜過濾法：15~150cfu。 |
100cfu以內(nèi)報(bào)整數(shù)，超過100cfu兩位有效數(shù)字。 |
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USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
否 |
平皿法：不超過250cfu；薄膜過濾法：記錄結(jié)果。 |
取兩位有效數(shù)字報(bào)告 |
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BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度計(jì)數(shù)》 |
否 |
平皿法：不超過300cfu；薄膜過濾法：不超過100cfu |
取兩位有效數(shù)字報(bào)告 |
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注： 1. 顯色劑一般為TTC，TTC全稱為0.5%氯化三苯四氮唑。加此顯示劑后，多數(shù)菌落顯示紅色。 2. TNTC全稱為多不可數(shù)，即Too Number To Count。 |
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菌落總數(shù)的測定，不同樣品有不同的特性，故在進(jìn)行此方面衛(wèi)生學(xué)測試時(shí)，結(jié)合行業(yè)需求，以及樣品的生產(chǎn)工藝、消費(fèi)對象、使用方式等需求，選擇合適的測試操作流程，同時(shí)保證在報(bào)告結(jié)果時(shí)，亦需根據(jù)市場所選用的方法進(jìn)行報(bào)告結(jié)果。
綜合以上，衛(wèi)生學(xué)的菌落測試在實(shí)驗(yàn)操作中雖然有差異，但總體的差異性不大，比如培養(yǎng)基都是非選擇性生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度基本在35℃左右，培養(yǎng)時(shí)間則溫度越高，時(shí)間則可減少。故保證菌落總數(shù)測試結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性時(shí)，根據(jù)實(shí)際需求，通過調(diào)節(jié)測試方法的取樣、稀釋液、培養(yǎng)條件等來建立更符合本實(shí)驗(yàn)室的菌落總數(shù)測試方法。
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