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      腐敗希瓦氏菌導致水產品腐敗的原因探析
      

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發(fā)布日期：2013-08-28  來源：食品安全導刊

      

      核心提示：從鱈魚表皮和內臟的混合菌群中分離純化出能夠穩(wěn)定代謝氧化三甲胺（TMAO）的腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）Y0612。使用非抑制性離子色譜對腐敗希瓦氏菌代謝TMAO 的能力進行了分析，研究菌株對TMAO 的代謝規(guī)律。
      
  
        
     
    
  
      
  
        
     
    
  
      

      

       腐敗希瓦氏菌導致水產品腐敗的原因探析
      

      摘　要：從鱈魚表皮和內臟的混合菌群中分離純化出能夠穩(wěn)定代謝氧化三甲胺（TMAO）的腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）Y0612。使用非抑制性離子色譜對腐敗希瓦氏菌代謝TMAO 的能力進行了分析，研究菌株對TMAO 的代謝規(guī)律。確定Y0612 對TMAO 的還原沒有受氧氣的抑制，在有氧條件下比厭氧條件下對TMAO 還原效果更好；溫度為15~35℃之間TMAO 的代謝率隨著溫度升高而略有升高。在水產品的加工中，通過SSOP 保持衛(wèi)生的操作，減少與氧氣的接觸，對環(huán)境溫度進行控制， 對于該菌均有一定的抑制作用，減少水產品的腐敗。
      

      關鍵詞：腐敗希瓦氏菌 氧化三甲胺 代謝 腐敗 水產品
      

      氧化三甲胺 (trimethylamine-N-oxide，TMAO) 分子式為 (CH3)3NO，廣泛分布于海產硬骨魚類的肌肉中[1]，是許多海洋魚類的肌肉中非蛋白氮的重要組成部分，具有特殊的鮮味[2]。在貯藏及運輸過程中，TMAO 在環(huán)境微生物和水產品自身內源性酶的作用下[3]，降解產生三甲胺（TMA），進而生成二甲胺（DMA）和甲醛（FA）等[4]。
      

      三甲胺是海洋魚類腐敗的惡臭成分[5]，在海產魚類加工過程中排放的高濃度廢水中含量十分豐富[6~7]。三甲胺具有毒副作用，會抑制大分子（如DNA、RNA 和蛋白質）的合成，對動物胚胎具有致畸作用[8]。二甲胺具有魚腐臭的特殊氣味，是城市污水的主要臭源之一。
      

      甲醛可與蛋白質、氨基酸結合，使蛋白質變性，使魚肉質構變差、疏水性增加，導致魚肉質量變差甚至變質。甲醛嚴重干擾人體細胞正常代謝，對細胞具有極大傷害作用，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為致癌物質，能引起各種癌癥，特別是白血病[9~10]。目前水產品中的甲醛問題已成為全球公共衛(wèi)生關注的焦點，并被列入國家食品安全戰(zhàn)略研究的重點。很多人認為水產品甲醛來源于外源性添加，實際上，有相當量的甲醛是水產品自身的微生物代謝產生的。在儲藏過程( 包括冷藏和冷凍) 中，水產品在酶和微生物的作用下可產生甲醛。甲醛生成受到多種因素的影響，包括冷藏狀態(tài)、冷藏溫度、添加物質、加工工藝等[11~16]。
      

      本文對能夠穩(wěn)定代謝氧化三甲胺（TMAO）的細菌Y0612 進行了研究，最終確定該菌為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），利用非抑制性離子色譜對其代謝TMAO 的能力進行了分析，對細菌的TMAO 代謝規(guī)律進行了研究。
      

      1 材料與方法
      

      1.1 材料、試劑與儀器
      

      1.1.1 材料：新鮮太平洋真鱈，購于青島市齊東路水產品市場。
      

      1.1.2 試劑：氧化三甲胺(AR)，三甲胺溶液(AR)，二甲胺溶液(AR)，成都市科龍化工試劑廠；3mmol/L 甲烷磺酸溶液（GR）， 美國安捷倫公司。
      

      1.1.3 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 15，F(xiàn)eCl3 0.01， pH7.2~7.5，121℃滅菌20min；TMAO 經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后按2.0 mg/ml 的終濃度添加。Biolog 培養(yǎng)基成分參照謝家儀[17]。
      

      1.1.4 儀器：DL-CJ-2N 高性能無菌實驗臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；離子色譜檢測儀IC2000，美國安捷倫公司；722S 分光光度計，上海浦東物理光學儀器廠；SK-1 快速混勻器，常州精宏實驗設備有限公司；LDZX-40BI 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。
      

      1.2 穩(wěn)定代謝TMAO 菌株的獲取與菌種鑒定
      

      1.2.1 菌株的獲取
      

      超凈臺上，取鱈魚表皮和內臟適量，經(jīng)無菌研缽研磨后， 置于含100ml 無菌生理鹽水的三角瓶內，170r/min，25℃振蕩培養(yǎng)1h。取10ml 上述菌體原液，接種到含有100ml 富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，170r/min，25℃振蕩培養(yǎng)24h。梯度稀釋上述培養(yǎng)液，涂布平板后，在適宜條件下培養(yǎng)24h，依據(jù)平板的菌落數(shù)，選恰當稀釋度且生長狀況良好的菌為對象，進行菌種的分離。選取不同特性的菌落，進行多次反復的劃線培養(yǎng)，直至菌種純化。
      

      1.2.2 菌株代謝TMAO 能力的檢測
      

      采用非抑制性離子色譜進行檢測，參考郭修娟[18] 方法。
      

      1.3 影響細菌TMAO 代謝因素的研究
      

      1.3.1 氧氣對細菌代謝TMAO 的影響
      

      取菌株種子液5ml 接種到250ml 三角瓶中，瓶內添加100ml 含TMAO 2.0 mg/ml 的2216E 培養(yǎng)基，分別采用170r/ min 振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)的方法分析有氧和厭氧條件下細菌的代謝能力，培養(yǎng)溫度25℃，每隔2h 取樣一次，按照1.2.2 方法進行檢測；同時用分光光度計在660nm 處測吸光值，作為菌株生物量測定的參考值。
      

      1.3.2 溫度對細菌代謝TMAO 的影響
      

      取Y0612 種子液5ml 接種到100ml 含TMAO 2.0 mg/ ml 的培養(yǎng)基中，分別于15℃、25℃、35℃，170r/min，振蕩培養(yǎng)24h，每隔一定時間取樣，按照1.2.2 方法進行檢測；同時測定菌液660nm 的吸光值。
      

      2 結果與分析
      

      2.1 菌株的TMAO 代謝能力
      

      根據(jù)菌株代謝TMAO 的離子色譜分析結果，做出發(fā)酵24h 時TMA 與TMAO 的含量變化曲線，如圖1 所示。
      

      發(fā)酵進行4h 時，非抑制型離子色譜檢測到了TMA 的產生， 進行24h 時TMAO 含量已產生較大幅度的下降，降解率相當于初始含量的70%。
      

      

      

      2.2 影響因素分析
      

      2.2.1 氧氣對細菌代謝TMAO 的影響
      

      腐敗希瓦氏菌Y0612 為兼性厭氧菌，氧氣的存在能夠有效促進菌株的生長。在有氧與厭氧條件下，前4h 菌株對TMAO 的代謝基本一致，10h 后，有氧條件下TMAO 代謝速率平穩(wěn)上升，厭氧條件下增長緩慢（圖2）。由于反應開始時，培養(yǎng)基中有一定量的溶解氧，一段時間后這部分氧消耗完畢，達到完全厭氧的狀態(tài)。TMAO 在生長對數(shù)期被還原為TMA( 圖3）。
      

      

      2.2.2 溫度對細菌代謝TMAO 的影響
      

      對腐敗希瓦氏菌在15℃、25℃、35℃條件下培養(yǎng)24h 后， 對發(fā)酵液中細菌生物量和TMAO、TMA 含量的檢測結果分別如圖4 和圖5 所示。溫度為15℃ ~35℃之間TMAO 的代謝率基本上隨著溫度升高而略有升高。
      

      

      

                                                              A
      

      

      3 討論
      

      引起海水魚類及制品中甲醛超標的原因除了不法分子的外源添加外，更主要的是某些海產品含有的氧化三甲胺能夠在微生物和自身內源性酶的作用下產生甲醛；此外，一些加工過程如高溫[19] 或添加劑[20] 等非酶途徑也會導致海水魚中甲醛含量的增高。目前，在水產品中TMAO 的代謝方面的研究側重于內源性的氧化三甲胺酶(TMAOase) [21]，這是一類可以將TMAO 分解為DMA 和FA 的酶系統(tǒng)，而在關于由微生物引起的水產品腐敗及其對三甲胺、二甲胺和甲醛產生所起的作用方面的研究則相對較少[22]。TMAO 還原酶（TMAO reductase）是一類存在于某些微生物體內能夠代謝TMAO 的酶，其催化作用是將TMAO 降解為TMA[23]。TMAO 還原酶催化TMAO 還原，參與菌的呼吸產能過程，需要一系列的電子供體等組成成分 [24]，甲酸鹽、細胞色素、FMN 和NADH 都可以作為TMAO 還原酶催化TMAO 還原的電子中間傳遞物質[25]。這種氧化三甲胺還原酶已在許多海洋細菌、淡水池塘光合細菌和腸道細菌中發(fā)現(xiàn)。
      

      從鱈魚體表和內臟混合菌群分離純化到的菌株Y0612 通過非抑制性離子色譜分析，證明其有代謝TMAO 的能力，代謝產物為TMA，說明該菌株能夠產生氧化三甲胺還原酶。通過16S rDNA 序列分析和進化樹的構建及Biolog 生物鑒定法得出結論，該菌株為腐敗希瓦氏菌。該菌株在有氧和無氧條件下均具有還原TMAO 的能力，對魚肉的腐敗具有促進作用。在水產品的加工中，通過SSOP 保持衛(wèi)生的操作，減少與氧氣的接觸，對環(huán)境溫度進行控制，對于該菌均有一定的抑制作用，可減少水產品的腐敗。本研究為對水產品在儲存加工過程中防止腐敗和保持良好的鮮度，為水產加工廢水惡臭控制以及對水產品內源性甲醛產生途徑和機理的闡明及其有效控制提供了一定的理論依據(jù)。
      

      參考文獻
      

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