使用說明書
 （Code No.：NPK- 500）
  TOYOBO CO., LTD. Biochemical Operations Department
OSAKAJAPAN

—目錄—
目錄                                                                                            頁數(shù)
 1．前言.......................................................................................................................... 1
2．使用前須知.............................................................................................................. 1
3．試劑盒中所包含的物品.......................................................................................... 2
4．操作程序.................................................................................................................. 2
     1］試劑盒以外所需要的其他物品...................................................................... 2
         （1）試劑............................................................................................................. 2
         （2）器具及器材................................................................................................. 3
     2］抽提流程.......................................................................................................... 3
     3］樣品前處理...................................................................................................... 4
     4］使用MFX-2000進(jìn)行Plant DNA抽提......................................................... 4
         （1）操作程序的選擇......................................................................................... 4
         （2）加溫block以及回收block溫度的設(shè)定.................................................. 4
         （3）附帶專用過濾器的tip安裝....................................................................... 5
         （4）專用試管的安裝......................................................................................... 5
         （5）試劑的安裝................................................................................................. 6
         （6）樣品的安裝................................................................................................. 8
         （7）抽提開始..................................................................................................... 8
         （8）樣品的回收................................................................................................. 8
     5］使用手工方法進(jìn)行Plant DNA抽提............................................................. 8
5．一般樣品的分析...................................................................................................... 9
     1］DNA定量測定................................................................................................ 9
     2］電泳............................................................................................................... 10
     3］PCR............................................................................................................... 10
6．抽提實(shí)例................................................................................................................ 10
7．疑難解答................................................................................................................ 11
 
注意事項(xiàng)
 
本試劑盒中所包含的所有試劑屬研究用試劑。請不要用于診斷或臨床等場合。在使用本試劑盒的時候，請嚴(yán)格遵守常用的實(shí)驗(yàn)室安全操作程序。
Hoffman-La Roche Ltd.擁有PCR方法的專利權(quán)。

1．前言
MagExtractor-Plant Genome-利用在Chaotrpic（鹽）的情況下，DNA吸附于硅膠表面的特性，進(jìn)行plant DNA的抽提。本試劑盒與自動核酸抽提裝置MFX-2000并用，可簡便地從植物葉及植物培養(yǎng)細(xì)胞等植物樣品中抽提出高純度的plant DNA。另外，本試劑盒也可用作手動抽提用試劑盒而加以使用。
 
特征
·本試劑盒用于從植物標(biāo)本如培養(yǎng)細(xì)胞和葉子以及其它植物組織中進(jìn)行DNA抽提。
·無需進(jìn)行乙醇沉淀，可以實(shí)現(xiàn)快速抽提。
·不使用苯酚。
·不使用RNase。
·所抽提的DNA被回收到TE緩沖液中，可以被直接用于PCR或者其它分析方法。
 
2．使用前須知
·MagExtractor-Plant Genome-適用于以下樣品：

對應(yīng)樣品	樣品量	主要用途
植物標(biāo)本，如葉子以及培養(yǎng)細(xì)胞	0.01到0.1g	PCR

參見第十頁“6. 抽提實(shí)例”。
 
·有關(guān)溶解液的儲存
由于本試劑盒是在低溫下進(jìn)行儲存以及運(yùn)輸，因此溶劑中的表面活性劑成分將有所沉淀。按照以下的步驟，請?jiān)谑覝兀?0~30℃）下進(jìn)行相應(yīng)的溶解以及儲存。從溶劑的表面上看，有些情況下可能沒有任何沉淀出現(xiàn)，但是，可能已形成了透明凝塊，故在使用之前，務(wù)必進(jìn)行以下操作。同樣，如果在儲存期間產(chǎn)生沉淀，也進(jìn)行相同的操作并進(jìn)行溶解。其它試劑請?jiān)?℃下進(jìn)行儲存。
（參照第2頁“[3] 試劑盒中包含的物品”。）
 
（1）在50℃的水浴下，加熱10分鐘。
（2）輕輕地上下轉(zhuǎn)動瓶子以溶解沉淀的凝塊。（劇烈搖動會形成泡沫。）
（3）在50℃的水浴下中，再次加熱5分鐘。
（4）輕輕地上下轉(zhuǎn)動瓶子以進(jìn)行完全溶解。
如果在溶液中仍然有一些未溶解的部分，則在水浴下中再次加熱5分鐘并上下轉(zhuǎn)動混合直到未溶解的部分完全被溶解。
（可能會形成透明凝塊，請進(jìn)行兩次檢查以確保完全溶解。）
 
·建議在室溫（20~30℃）下使用本試劑盒。低溫會導(dǎo)致溶劑成分的沉淀可能會影響
本試劑盒的性能。

3．試劑盒中所包含的物品
在本試劑盒中含有可以抽提出100份RNA樣品的試劑。請?jiān)谝韵碌臏囟认聝Υ孢@些試劑：

試劑	容量	儲存
溶解液	40ml	溶解后，在室溫（20~30℃）下保存。
吸附液	90ml	4℃
洗凈液	200ml	4℃
磁珠	5ml	4℃

·吸附液以及洗凈液含有高濃度的蛋白質(zhì)變性劑。在處理時應(yīng)小心謹(jǐn)慎并戴上手套以及其它防護(hù)用具并且實(shí)施適當(dāng)?shù)陌踩�預(yù)防措施。萬一試劑沾在手或者皮膚上，請用清水充分清洗。如若碰到眼睛，請立刻用清水清洗，然后去看醫(yī)生。

 

4．操作程序
1］試劑盒需要的其他物品
（1）試劑
·液氮
·氯仿/異戊醇
將氯仿：異戊醇*1以比例24：1（體積比）混合
·滅菌水
市場上銷售的純水或者經(jīng)過高溫高壓蒸汽滅菌消毒處理過的milli Q水。
·乙醇
99.5％以上的特級品。用于手動抽提時，請使用70％的乙醇。
·TE緩沖液（pH 8.0）
10mM Tris-HCI（pH 8.0），lmM EDTA（pH 8.0）
 
*1又被稱為3-甲基-1-丁醇。

 
（2）器具及器材
·微量移液器
·微量移液器用tip
·（具有大約3,000到12,000 rpm的）臺式離心機(jī)
·加溫block（也可以是水浴槽，65℃）
·1.5ml微型試管
 
當(dāng)使用MFX-2000時：
·抽提專用試管（Code No.：MFX-301）.......................................... 用于樣品回收
·抽提專用6連試管（Code No.：MFX-302）................................... 用于進(jìn)行抽提
·附帶專用過濾器的tip（Code No.：MFX-402）
·安裝試劑用試管（50ml、15ml、2ml）*1

 

 

2］抽提流程
經(jīng)簡單的前處理之后，MagExtractor -Plant Genome-可以使用MFX-2000進(jìn)行自動抽提。以下是關(guān)于抽提流程的說明。

 

 

 

 3］樣品前處理
進(jìn)行DNA抽提時使用MagExtractor-Plant Genome-試劑盒進(jìn)行DNA抽提時要求對所使用的樣品進(jìn)行前處理。（參照第三頁上的“[4] –[2]抽提流程”。）
根據(jù)以下步驟，進(jìn)行前處理。
 
（1）將儲存在液氮中的0.01~0.1g的樣品磨碎。（快速進(jìn)行該項(xiàng)，并同時補(bǔ)充液氮以避免樣品融解。）
（2）將樣品移入1.5ml試管中。（使用液氮或者其它方法對使用的藥匙及試管進(jìn)行提前冷卻以避免已磨碎的樣品被融解。）
（3）在樣品中添加300μl的溶解液并進(jìn)行充分混合。（確認(rèn)其沒有沉淀后再進(jìn)行添加。如果有沉淀，請參照第一頁“2. 使用前須知”并對沉淀進(jìn)行溶解。）
（4）使用旋渦混合器，劇烈振動10秒鐘。（只有將樣品完全浸沒溶劑之后，才能進(jìn)行振動。）
（5）在65℃下培育10分鐘。（使用旋渦混合器，每隔3到4分鐘進(jìn)行共2次的劇烈攪拌，每次5秒鐘。）
（6）添加300μl的氯仿/異戊醇。
（7）劇烈混合3~5秒鐘。（旋渦混合器可能無法使溶液被完全均勻地混合，可用手劇烈搖動使其混合。）
（8）用離心機(jī)以12,000 rpm的速度進(jìn)行1分鐘的離心。（根據(jù)樣品的不同情況，可能會有少量的沉淀。如果發(fā)生了這種情況，請?jiān)儆秒x心機(jī)進(jìn)行2~3分鐘的離心。）
（9）將250μl的上清液回收到一個未使用過的1.5ml試管中。（如果上清液少于250μl，則必須非常仔細(xì)地進(jìn)行操作，同時對溶液界面進(jìn)行抽吸以回收上清液。上清液的量因樣品而有所不同。
例：         0.1g的煙草大約有250μl
                                                    0.1g的水稻植物大約有200μl
（10）添加600μl的吸附液。
（如果上清液少于100μl，則添加750μl吸附液。）

 4］使用MFX-2000進(jìn)行Plant DNA抽提
在使用MFX-2000之前，請務(wù)必通讀完其使用說明書。
（1）操作程序的選擇
現(xiàn)在可供使用的MFX-2000程序可針對DNA、Total RNA、質(zhì)粒DNA等的抽提。使用MagExtractor-Plant Genome-請用第13號操作程序。
 
（2）加溫block以及回收block溫度的設(shè)定
將加溫block以及冷卻 block設(shè)定成如下所述的溫度：
  加溫block 冷卻 block
溫度設(shè)定 OFF 10℃

·由于不使用加溫 block，請切斷其電源。
·使用簡易保冷block時，請將block事先置于冷藏庫或是低溫室進(jìn)行予冷。簡易保冷可用于回收液的臨時保冷。

（3）附帶專用過濾器的tip安裝
將具有專用過濾器的tip安裝在tip架上。相關(guān)數(shù)量，請參見以下表格。
·請務(wù)必使用附帶專用過濾器的tip（Code No.：MFX-402）。
·tip已經(jīng)過γ射線消毒。在進(jìn)行安裝時，一定要使用手套。
·安裝超過規(guī)定數(shù)量的tip不會引起任何問題。
·將必要量的tip從左下方開始，垂直地排列在tip架上。有關(guān)安裝位置的更多細(xì)節(jié)，請參見MFX-2000使用說明書。

 

樣品數(shù)	tip數(shù)	樣品數(shù)	tip數(shù)
1	6	13	39
2	8	14	41
3	10	15	43
4	12	16	45
5	17	17	50
6	19	18	52
7	21	19	54
8	23	20	56
9	28	21	61
10	30	22	63
11	32	23	65
12	34	24	67

 （4）專用試管的安裝
根據(jù)樣品個數(shù)，將專用試管（編號.：MFX-301）或者特制的6連試管（編號：MFX-302）安裝在抽提架的A到F的插槽以及回收block上。
·除了以上提及的專用試管，不得將其它試管安裝在抽提架中，否則容易產(chǎn)生故障。
·專用試管（編號：MFX-301）以及帶螺旋帽的1.5ml試管*1被設(shè)置在回收block中。
·有關(guān)設(shè)置位置的更多細(xì)節(jié)，請參照MFX-2100使用說明書。
 
*Assist試管（編號：72.692）等

 
（5）試劑的安裝
將試劑注入到規(guī)定的試管中并將它們安裝在指定的試劑架上。
·確認(rèn)每種試劑是否都已回復(fù)到室溫。
·試劑的必需量依據(jù)樣品的數(shù)量而定。請參照下頁的表格，安裝試劑。
·在進(jìn)行分裝之前，請充分地攪動磁珠并進(jìn)行確認(rèn)，直到這些磁珠已均勻混合。然后將它們分裝到2ml試管中。另外，在注入磁珠后，請立刻（10分鐘之內(nèi)）啟動儀器，否則會導(dǎo)致產(chǎn)物有很大的差異并有可能導(dǎo)致儀器發(fā)生故障。
·使用微量移液器分裝磁珠。對于其它試劑，則將試管上的刻度標(biāo)記作為分裝時的標(biāo)準(zhǔn)。
·抽提后所剩的試劑可以被再次使用。但是，如果長時間存放不用，則由于蒸發(fā)或者其它現(xiàn)象液體成分可能會發(fā)生變化。請務(wù)必注意。
·請注意本試劑盒并不包含滅菌水、乙醇（99.5％以上的特級品）以及TE緩沖液（pH8.0）。（參照第2頁上的“4 - [1] - (1)試劑”。）

安裝位置	試劑名	試管容量
1	滅菌水	50ml
2	洗凈液	50ml
5	乙醇	50ml
7	磁珠	2ml
9	TE緩沖液（pH8.0）	15ml

 

每種試劑的使用劑量
 

試劑	滅菌水	洗凈液	乙醇	磁珠	TE
試管容量	50ml	50ml	50ml	2ml	15ml
安裝位置	1	2	5	7	9

樣品數(shù)	1	5 (20)	5 (20)	5 (20)	0.5 (1.5)	2 (5)
	2
	3		10 (20)	10 (20)
	4
	5		15 (20)		0.8 (1.5)
	6	10 (20)		15 (20)		3 (5)
	7
	8		20 (20)
	9
	10			20 (20)
	11		25 (35)
	12
	13				1 (1.5)
	14		30 (35)	25 (35)
	15
	16	15 (20)	35 (35)			4 (5)
	17
	18			30 (35)	1.3 (1.5)
	19		40 (45)
	20
	21
	22		45 (45)	35 (45)
	23				1.5 (1.5)
	24

 

 

 （6）樣品的安裝
按照第4頁上的“4 – [3] 樣品前處理”來制備樣品，并把它們安裝在抽提架上。
·如果使用帶有螺旋帽的1.5ml樣品試管，則剪掉蓋子連結(jié)部后將它們放在樣品的安裝位置上。
·將它們按照順序安裝在編號1～24的插孔中。
 
（7）抽提開始
按照以下標(biāo)準(zhǔn)，開始進(jìn)行抽提。
①確認(rèn)是否按照所規(guī)定的說明安裝了樣品、試管、專用試管（抽提架以及回收block）以及專用tip。
②確認(rèn)每個架子的安裝位置以及工作臺是否已完全收納到里面（直至聽到“咔喳”聲）。關(guān)上機(jī)器前門。（如果機(jī)器前門未完全關(guān)上，則抽提不會開始。）
③接通MFX-2000的電源。
④在液晶顯示屏上將出現(xiàn)“操作程序”以及“樣品數(shù)”。輸入操作程序“13”并且在“樣品數(shù)”中輸入樣品數(shù)量的數(shù)值。
⑤屏幕上會顯示提示“請按下啟動鍵”，后按下“START”。
⑥抽提啟動后液晶顯示屏上會顯示“操作中”。
 
（8）樣品的回收
在完成抽提后，打開機(jī)器前門并取出樣品。
·在完成抽提后，所抽提的DNA將回收到安裝在回收block上的試管中。在液晶顯示屏上也將再次出現(xiàn)“請按下啟動鍵”。
·在已經(jīng)證實(shí)了儀器已完全停止運(yùn)轉(zhuǎn)之后，從回收block中取出試管并在冷藏或者在低溫（4~10℃）下儲存直到再次使用這些試管。
·從磁珠中溶出的DNA，由于使用的是大約100μl的溶出液（TE緩沖液），因此回收液也為100μl左右。

 

5］使用手動法進(jìn)行Plant DNA抽提
本試劑盒也可以用于手工DNA抽提。可按照以下步驟進(jìn)行抽提。
·對于磁珠分離，建議使用市場上銷售的1.5ml微型試管用磁性臺架。另外，使用臺式離心機(jī)以3,000 rpm 程度離心15秒鐘也能夠進(jìn)行分離。
·未包含在本試劑盒中的其它必需物品
請參照第2頁“4 – [1] – (1)試劑”。
請事先制備將特級乙醇與滅菌水按7：3比例混合的70％乙醇溶液。（每個樣品需要大約2ml。）
 

 
①取出按照第4頁“4 – [3] 樣品前處理”制備的樣品。
②添加40μl磁珠。（在使用之前請將磁珠進(jìn)行充分的混合。）
③使用試管混合器來進(jìn)行1分鐘的劇烈混合。［DNA的吸收］
④將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此時，對這些磁珠進(jìn)行數(shù)次顛倒混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。）
⑤去除上清液。
⑥添加900μl洗凈液。
⑦使用旋渦混合器劇烈混合5秒鐘。（此時，確認(rèn)磁珠是否已被充分地分散以及混合。）
⑧將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此時，對這些磁珠進(jìn)行數(shù)次顛倒混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。）
⑨去除上層清液。
⑩重復(fù)步驟⑥~⑨。
⑾添加900μl的70％乙醇溶液。
⑿使用旋渦混合器劇烈混合5秒鐘。（此時，確認(rèn)磁珠是否已被充分地分散以及混合。）
⒀將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此時，對這些磁珠進(jìn)行數(shù)次混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。）
⒁去除上清液。
⒂重復(fù)步驟⑾~⒁。（盡可能多地去除包括乙醇在內(nèi)的任何殘留在蓋子上的物質(zhì)。）
⒃添加100μl TE緩沖液。
⒄使用試管混合器劇烈混合1分鐘。［DNA的溶出］
⒅將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。
⒆將含有DNA的上清液回收到一個未用過的1.5ml微型試管中。

 

5．一般樣品的分析
請按照以下注意事項(xiàng)進(jìn)行操作。
1］DNA定量
·當(dāng)用吸收度檢測法進(jìn)行DNA定量測定時，請務(wù)必用離心機(jī)分離所回收的溶液（12,000 rpm， 1分鐘）并使用上清液。
·當(dāng)計算A260nm/A280nm比例以及DNA濃度時，請務(wù)必用A320nm數(shù)值進(jìn)行校正。

DNA濃度	(A260-A320) x 50μg/ml
A260nm/A280nm	(A260-A320) /(A280-A320)

 

 2］電泳
·若將一部分回收液直接用于電泳，請將Loading Dye的量增加為通常的1.5到2倍，否則可能會發(fā)生樣品無法沉入樣品孔中，使得電泳失效。
 3］PCR
·回收液中混有大約10％的乙醇溶液。如果直接用于PCR，可能會阻礙反應(yīng)的進(jìn)行。因此，不要超過反應(yīng)總液的五分之一（即：在每50μl的反應(yīng)液中最多可有10μl）。
·可能會在所回收的溶液中混入了少量的磁珠。但這并不會阻礙PCR。

6．抽提實(shí)例
以下是使用MFX-2000從0.1g樣品中進(jìn)行抽提的實(shí)例。

樣品	回收量
煙草（葉子）	3~5μg
煙草（培養(yǎng)細(xì)胞）	2~3μg
水稻植物（葉子）	3~5μg
Arabidopsis thaliana（葉子）	1μg
番茄（葉子）	3μg
卷心菜（葉子）	3μg
玉米（葉子）	3~4μg

 

 

原因	對策
樣品過剩	即使使用規(guī)定量以上的樣品，也不會使回收量上升，反而會使效率下降。請減少樣品量。另外，有的樣品單位重量下體積可能會很大。如果無法浸沒在溶解液中，則也請減少樣品量。
破碎不充分	液氮下的凍結(jié)粉碎不充分是一個原因。進(jìn)行充分的破碎處理直到它成為細(xì)粉末。并請注意破碎時不要使樣品解凍。
溶解不充分 （1）氯仿抽提液為250μl左右的情況   （2）氯仿抽提液低于150μl或者非常少的情況	可能是溶解液與樣品之間混合不充分，或者樣品本身難以溶解所致。將溶解液與樣品進(jìn)行充分混合，使用旋渦混合器振動1分鐘后再進(jìn)行抽提。（通常為10秒鐘） 可能是樣品內(nèi)水份含量較少而吸收了部分溶解液。請?zhí)砑尤芙庖褐?/span>350~400μl并按照以上（1）的對策繼續(xù)進(jìn)行抽提，即可獲得良好效果。
試劑量不足 （MFX抽提）	確認(rèn)試劑量是否不足或者檢查殘留物的數(shù)量。如果幾乎沒有任何殘留物（200μl以下），說明試劑量不足。
吸附，溶出不充分 （手動抽提）	使用手動法時，通過使用試管混合器攪動1分鐘來使磁珠吸收DNA以及從磁珠中分離出DNA。（參照第9頁“5 - [5] 手動抽提法”(3)，(17)）。各攪拌10分鐘左右，則DNA回收量將會增加。