【試劑盒組成】
25 管 擴增反應(yīng)試劑球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存)
2 x 520 μl AIV 擴增反應(yīng)試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存)
2 x 25 μl 陽性對照 (Positive control; -20℃ 保存)
【保存條件】
試劑球需置干燥劑中保存在4℃,已融解的試劑球則需保存在零下20℃。其他試劑亦需保存在零下20℃。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合,不要旋渦振蕩含酶的擴增反應(yīng)試劑。
【操作程序】
1 樣本采集、存放及運輸
1.1 樣本采集:
所用取樣器材必須經(jīng)高壓或干熱滅菌。
若樣品為活禽,建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子:取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮幾次取咽喉分泌液,取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS(含抗菌素)的試管,充分洗滌拭子,然后在管壁擠干液體,轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。
若樣品為新鮮肌肉或臟器,取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨,加10ml PBS混勻,取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強,也可取50克肉樣,加入50ml無菌的PBS液,用Bagmixer均質(zhì)器處理后,取上清備用。
若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液,則直接取用。
1.2 存放:
分離后的樣本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過24hr; -70℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融3次)。
1.3 運輸:
采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。
2 樣本處理:
2.1 取n個1.5ml滅菌離心管(n = 樣本數(shù)+ 1管陰性對照+ 1管陽性對照),作好標(biāo)記。
2.2 首先加入600ul裂解液(裂解液即提取液,有很強的腐蝕性,切勿沾到皮膚或衣物,否則立即用大量清水沖洗并擦干),然后分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各200ul(一份樣本換用一個吸頭);再加入200ul氯仿,混勻器上振蕩混勻5sec(不宜過于強烈,以免產(chǎn)生乳化層,也可用手顛倒混勻)。
2.3 于12,000g離心15min(如有條件,于4℃進行離心)。
2.4 取與步驟2.1.1中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管,加入400ul異丙醇(-20℃預(yù)冷),作好標(biāo)記。吸取步驟2.1.3各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中(上清液應(yīng)至少吸取500ul,注意不要吸出中間層,該層富含DNA和蛋白質(zhì)),顛倒混勻。
2.5 12,000g離心15min,(注意固定離心管方向,即將離心管開口朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清,倒置于吸水紙上,沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干);加入600ul 75%乙醇(-20℃預(yù)冷),顛倒洗滌。
2.6 12,000g離心10min,(注意固定離心管方向,即將離心管開口朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清,倒置于吸水紙上,盡量沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)。
2.7 4,000g離心10sec(注意固定離心管方向,即將離心管開口朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置)將管壁上的殘余液體甩到管底部,用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一個吸頭,注意吸頭不要碰到有沉淀一面),室溫干燥5-10min(不宜過于干燥,以免RNA不溶)。
2.8 加入11ul DEPC水,輕輕混勻,溶解管壁上的RNA,2,000g離心5sec,冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁猓捍藭r的RNA最易受RNA酶降解,請在2小時內(nèi)進行PCR擴增)。
3 擴增反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備:
3.1 計算所需的反應(yīng)數(shù)量 (n)
3.2 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3.3 每個試劑球需要 40 μl 試劑球溶液
3.4 在冰上溶解試劑,并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)
4 反應(yīng)的準(zhǔn)備
4.1 實驗中除從樣本中獲得的RNA 模板外,我們還建議設(shè)置陽性和陰性(水)對照
4.2 按照下表準(zhǔn)備擴增反應(yīng)試劑:
反應(yīng)組分--每個反應(yīng)體積
擴增反應(yīng)試劑 20 μl
樣品RNA 5 μl
總體積 25 μl
注意:實驗時 RNA 應(yīng)放在冰上,陽性對照建議加5 μl 試劑盒提供的陽性對照。建議PCR 過程中檢測樣本設(shè)置重復(fù),以便得到可靠的實驗結(jié)果。為了驗證陰性實驗結(jié)果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導(dǎo)致PCR 呈陰性反應(yīng),我們建議在測試樣本中加1 μl 的陽性對照作為spiking 對照(spiking control),同時進行PCR 反應(yīng)。
PCR 循環(huán):
1 個循環(huán) 42℃ 30 分鐘
95℃ 10 分鐘
40 個循環(huán) 95℃ 30 秒
53℃ 30 秒
72℃ 30 秒
5 實驗數(shù)據(jù)分析
PCR 的產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。
產(chǎn)物長度 : 246 bp
Spiking 對照陰性的實驗結(jié)果有幾個可能性: 樣本中不存在目的片段;樣本中目的片段的量低于檢測值;
【樣本中存有 PCR 抑制物】
試劑盒中設(shè)計spiking 對照 (spiking control) 是為了確定沒有發(fā)生PCR 抑制。如果樣本中加了陽性對照以后得出陰性結(jié)果,說明樣本中存在PCR 抑制物,那幺此次陰性的實驗結(jié)果就不能作為正確的結(jié)果,需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴增。
備注:
對于禽流感檢測樣本的獲得和前處理,可以參照國家標(biāo)準(zhǔn)“高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T 18936-2003)”推薦的方法進行,具體為:
【病料的采集】死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織樣品,進行分別處理或者同時處理;活禽病料應(yīng)包括氣管或泄殖腔拭子,尤其以采集氣管拭子更好;小珍禽用拭子取樣易造成損傷,可采集新鮮新鮮糞便。
【病料的保存】病料應(yīng)放在含有抗菌素的pH值7.0~7.4的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)(無PBS可用25%~50%的甘油鹽水)?股氐倪x擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定,組織和氣管拭子懸液中應(yīng)含有青霉素(2000IU/ml)、鏈霉素(2mg/ml)、慶大霉素(50µg/ml)和制霉菌素(1000IU/ml),但糞便和泄殖腔拭子所有的抗生素濃度應(yīng)提高5倍,加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0~7.4。在室溫放置1h~2h后樣品應(yīng)盡快處理,沒有條件的可在4℃存放幾天,也可于低溫條件下保存(-70℃貯存最好)。
【病料的處理】將棉拭子充分捻動、擰干后棄去拭子;糞便、研碎的組織用含抗生素的pH值7.0~7.4的等滲PBS溶液配成10%~20%(g/ml)的懸液,樣品液經(jīng)1000r/min離心10min,取上清液作為實驗材料。
【病料保存樣本保存和運送的一般原則是什么】
一般性原則:采集和運輸:
標(biāo)本采集用材料,如棉簽和拭子都應(yīng)一次性使用,所使用的抗腐劑和抗凝劑不應(yīng)對樣本和擴增反應(yīng)有降解或抑制作用。
對于RNA樣本,要特別注意混入操作人員的毛發(fā)、表皮細(xì)胞和痰液。
對于DNA樣本的運送:可在室溫下運送,建議在8小時內(nèi)完成,對RNA,10分鐘內(nèi)的運輸可在室溫進行,超過此時間,必須加冰運輸,既便低溫,一般亦不得超過4小時。
標(biāo)本的保存:對DNA:2℃-8℃可穩(wěn)定放置3天,RNA一律-20℃保存。
主要的擴增反應(yīng)抑制物質(zhì):血樣中用于抗凝的肝素,可以枸櫞酸鈉或EDTA-K3替代;血紅蛋白、乳鐵蛋白
【口腔棉簽拭子和瀉殖腔樣品如何保存】
口腔棉簽拭子和瀉殖腔樣本一般不單獨保存,在取樣后,應(yīng)盡快將其放入含PBS緩沖液(有時要加入抗生素)的離心管充分捻動,擰干后立即進行處理和使用,不立即使用時,推薦-70℃低溫保存。如果暫時不處理,也可將拭子留于離心管中低溫保存。
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