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包括48 個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑
請(qǐng)?jiān)谑褂们巴ㄗx操作說(shuō)明書(shū)
1. 試劑盒組成
￭ 25 管 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)
￭ 2 x 520 μl FMDVA-1 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)
￭ 2 x 25 μl 陽(yáng)性對(duì)照 (Positive control; -20oC 保存)
￭ 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase; -20oC 保存)
保存條件
試劑球需置干燥劑中保存在4oC，已融解的試劑球則需保存在零下20oC。其他試劑需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合，不要旋渦振蕩含酶的擴(kuò)增反應(yīng)試劑。
2. 操作程序
擴(kuò)增反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備
1. 計(jì)算所需的反應(yīng)數(shù)量 (n)
2. 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3. 每個(gè)試劑球需要 40 μl 試劑球溶液及0.4μl Taq酶。
4. 在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)
反應(yīng)的準(zhǔn)備
1. 實(shí)驗(yàn)中除從樣本中獲得的RNA 模板外，我們還建議設(shè)置陽(yáng)性和陰性（水）對(duì)照
2. 按照下表準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)試劑：
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反應(yīng)組分
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每個(gè)反應(yīng)體積
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擴(kuò)增反應(yīng)試劑
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20 μl
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樣品RNA
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5 μl
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總體積
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25 μl
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注意:
￭ 實(shí)驗(yàn)時(shí) RNA 應(yīng)放在冰上
￭ 陽(yáng)性對(duì)照建議加5 μl 試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照。
￭ 建議PCR 過(guò)程中檢測(cè)樣本設(shè)置重復(fù)，以便得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
￭ 為了驗(yàn)證陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導(dǎo)致PCR 呈陰性反應(yīng)，我們建議在測(cè)試樣本中加1 μl 的陽(yáng)性對(duì)照作為spiking 對(duì)照 (spiking control)，同時(shí)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
PCR 循環(huán):
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數(shù)據(jù)收集位點(diǎn)（FAM染料）
ABI7700 ABI7300 其它儀器
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1 個(gè)循環(huán) 42oC 30 分鐘 *
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95oC 10 分鐘 *
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5 個(gè)循環(huán) 95oC 10 秒 *
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45oC 30 秒 *
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72oC 60 秒 *
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40 個(gè)循環(huán) 95oC 15 秒 *
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58oC 60 秒 * * *
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( * 表示位點(diǎn)收集FAM讀數(shù))
3. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有幾個(gè)可能性：
1. 樣本中不存在目的片段；
2. 樣本中目的片段的量低于檢測(cè)值；
3. 樣本中存有 PCR 抑制物。
試劑盒中設(shè)計(jì)spiking 對(duì)照 (spiking control) 是為了確定沒(méi)有發(fā)生PCR 抑制。
如果樣本中加了陽(yáng)性對(duì)照以后擴(kuò)增結(jié)果的Ct值接近40（或者接近陰性對(duì)照的Ct值），說(shuō)明樣本中存在PCR 抑制物，那幺此次陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不能作為正確的結(jié)果，需要重新開(kāi)始樣本核酸的提取和PCR 擴(kuò)增。北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
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