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      PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒--MagExtractor®-PCR & Gel Clean u

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-05-22   瀏覽次數(shù):1500
      產(chǎn)品索引 5872
      中文名稱: PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒
      英文名稱: MagExtractor®-PCR & Gel Clean up-
      產(chǎn)品編號: NPK - 600

      產(chǎn)品類別:

      分子生物學
      生產(chǎn)廠家: TOYOBO
      產(chǎn)品價格: 300元
      產(chǎn)品規(guī)格: 50次
      DNA Fragment Purification Kit
      MagExtractor®
      -PCR & Gel Clean up-
      使用說明書
      (Code No. : NPK – 601)
      TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
      OSAKAJAPAN
       —目錄—
      [1] 前言 ........................................................................................... 1
      [2] 純化流程...................................................................................... 2
      [3] 試劑盒中所包含的物品................................................................. 3
      [4] 試劑盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
      [5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
      [6] 回收瓊脂糖凝膠........................................................................... 5
      [7] 疑難解答...................................................................................... 8
       
      注意:
             本試劑盒中所包含的都是研究用試劑。請不要用于診斷,臨床等場合。在使用本試劑盒的時候,請嚴格遵守實驗室的基本注意事項,注意安全。由于本試劑盒內(nèi)含有對人體有害的試劑,所以請務(wù)必嚴格遵守各試劑的相關(guān)使用說明書,按要求使用保護罩等防護措施。

       [1] 前言
             MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic(鹽)試劑存在的情況下,核酸能吸附在硅膠上的特性1,用于手動對DNA片段進行純化。本試劑盒采用磁硅膠粒子,若使用磁性臺架,則能最大限度地減少復雜的離心操作,能夠快速地的純化DNA片段。
      1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
      特征
      ·從DNA溶液(約100μl),以及TAE·TBE瓊脂糖凝膠(約0.3g)中,
      能夠以平均回收率60~70%比例回收DNA片段(約100bp~50kbp)。
      ·能夠在5分鐘之內(nèi)從DNA溶液中,或者在15分鐘之內(nèi)從瓊脂糖凝膠
      中回收DNA片段。
      ·由于在室溫下瓊脂糖凝膠可以被融解,因此無需進行加熱反應。
       
      * 要徹底去除混雜在回收液中的乙醇時則需要進行加熱處理(55℃)。
      試劑盒的用途
      ·脫鹽,去除dNTPs。
      ·去除引物。
      ·去除酶(堿性磷酸酶等)。
      ·從電泳后的瓊脂糖凝膠塊中回收DNA。
      回收的DNA的用途
      ·RI.Non-RI測序反應
      ·限制酶反應
      ·標記反應
      ·雜交反應
      ·連接反應
      ·轉(zhuǎn)化反應
      ·擴增反應
      [2] 純化流程      
       下圖顯示為使用MagExtractor-PCR &
        Gel Clean up-時的純化流程。

      純化DNA片段
      Elute
      75%乙醇
      洗凈液
      溶出液
           磁石
      磁性或離心分離
      磁珠
      Wash
       
      Bind
       
      Melt
       
      凝膠塊
      吸附液
      電泳后的凝膠

      [3] 試劑盒中所包含的物品    
       
             本試劑盒中包含以下試劑。(200次份)
            
       
      試劑量
      保存條件
      吸附液*
      88ml
      避光室溫保存
      洗凈液*
      132ml
      室溫保存
      磁珠
      7ml
      室溫保存
       
      *吸附液,洗凈液在低溫情況下會析出結(jié)晶。請一邊用手捂暖,一邊
      將其倒轉(zhuǎn)混合讓結(jié)晶溶解后使用。另外,吸附液及洗凈液內(nèi)含有蛋白
      變性劑。在使用時務(wù)必注意,萬一沾到身體,請立刻用清水沖洗。
       
      [4] 試劑盒以外所需要的其他物品
       
      1.試劑
      ·滅菌蒸餾水<溶出液>
      ·75%乙醇<洗凈用>
       
      2.器具,器材
      ·1.5ml小型試管用磁性臺架
      ·簡易臺式離心機
      ·漩渦混合器
      ·Heat Block 55℃(用于在需要去除混于回收液中的乙醇的場合)
       
      *可使用本公司的磁性臺架Magical Trapper(Code No.:MGS-101)等產(chǎn)品。
       [5] 回收DNA溶液
       
      1.前言
      ·本操作程序用于從DNA溶液(約100μl)中回收DNA片段。
      ·能夠回收的DNA大小約為100bp~50kb。另外,40bp以下的核酸
      幾乎能夠被加以除去。
      · 磁珠的最大吸附量為每30μl磁珠大約吸附5μg。使用時請以2.5μg左右為參考量。
      ·能夠從PCR反應液,限制酶反應溶液,堿性磷酸酶反應液等各種反
      應液中回收DNA。
      ·回收后的DNA,能夠用于限制酶處理、測序、連接、標記、雜交等多種反應
      2.操作程序      
      DNA溶液(100μl)1
      ↓← 400μl吸附液
      ↓← 30μl磁珠2)
      ↓不時用漩渦混合器攪拌,并放置約1~2min(室溫)
      B/F(固/液)分離3
      ↓←(600μl洗凈液)4
      ↓漩渦混合器攪拌10sec,
      B/F分離。3
      ↓←1ml75%乙醇4
      ↓漩渦混合器攪拌10sec,
      B/F分離。3
      瞬時高速離心,徹底去除上清部分。
      (打開小型試管的蓋子,55℃下放置5min,干燥)4
      ↓←25~100μl蒸餾水
      ↓漩渦混合器攪拌10sec,
      (在無法充分將粒子分離的情況下,請用pipetting來分離粒子。)
      ↓放置2min
      B/F分離,回收上清液。5
      1)請盡量不要含礦物油。
      2)使用磁珠前,請徹底懸濁混合后再使用。
      3)將試管放置在磁性臺架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持續(xù)去除
      上清部分。通過乙醇清洗時,可以通過將上清液倒入其他容器進行去除。
      B/F分離時推薦使用對應于微型試管的磁性臺架,但也可用簡易臺式離心機,用大約6,000r.p.m程度,5sec.的離心進行分離。g會根據(jù)離心機的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化,所以請調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù),使得能更有效地集合粒子,并保證凝結(jié)不至于過度。
      4)請參照3.的表。
      5)回收液中少量混入的磁珠并不會有礙下一次的反應,但在測定吸附度
      等場合時,請通過瞬時高速離心除去磁珠。
       
      3.關(guān)于工序的省略,純化規(guī)模
      ·洗凈工序,加熱工序可以省略(請參照下表)
      用途
      洗凈
      干燥
      備注
      洗凈液
      75%乙醇溶液
      測序,限制酶反應,連接反應等的前處理
      1
      標準操作程序;厥盏暮怂崮苡糜Low Buffer系列的限制酶切斷。
      鹽的混入會產(chǎn)生影響的場合
      2
      吸附液和洗凈液含有高濃度的鹽分。
      乙醇的混入會產(chǎn)生影響的場合
      1次(2次)
      55℃,5min
      用于易受乙醇影響的前處理。
      要去除混入的酶的場合
      1
      1次(2次)
      用于去除堿性磷酸酶等。
      要通過吸光度來準確定量核酸濃度的場合
      1
      2
      吸附液內(nèi)含有能吸收紫外線的物質(zhì)。
       
      ·根據(jù)DNA溶液的量,可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
      液和磁珠的使用量。此時,無需減少75%乙醇溶液的使用量。
      [6] 回收瓊脂糖凝膠
       1.前言
      ·本操作程序適用于從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠(約0.3g)中回收
      DNA片段。本操作程序是以瓊脂糖濃度2%以下的凝膠為對象。
      要使用2%以上的凝膠時,推薦所使用凝膠的量少于0.3g。另外,本
      操作程序不需要使用特殊的低融點瓊脂糖凝膠。
      ·能夠回收的DNA大小約為100bp~50kbp。
      ·回收后的DNA主要用于連接反應、標記、測序等反應。
       
      2.操作程序
      瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色。
      在UV照射下(Long wave),為了使得目標條帶盡可能地變小,使
      用切割刀或手術(shù)刀等進行切開。
      把切開的瓊脂糖切細,放到1.5ml小型試管中。(此時稱得重量,如
      果大于0.3g則分幾次進行。)1
      ↓←400μl吸附液
      在凝膠完全溶解之前,將其放置在室溫中,并不時進行攪拌。2
      ↓←30μl磁珠3
      ↓經(jīng)常用漩渦混合器攪拌,并放置2min(室溫),
      B/F分離。4
      ↓←600μl洗凈液
      ↓漩渦混合器攪拌10sec,
      B/F分離。4
      ↓←1ml75%乙醇溶液5
      ↓漩渦混合器攪拌10sec,
      B/F分離。4
      瞬時高速離心,徹底去除上清部分。
      (打開微型試管的蓋子,55℃下放置5min,干燥)5

       
      ↓←25~100μl蒸餾水
      ↓漩渦混合器攪拌10sec
      (在無法充分分開粒子的情況下,請用pipetting來分散粒子。)
      ↓放置2min
      B/F分離,回收上清液6
       
      1)   將瓊脂糖凝膠制成切片,以利于溶解。
      2)   如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或凝膠難以溶解時,請加溫至55℃
      5min。
      3)   使用磁珠前,請徹底混合后再使用。
      4) 將試管放置在磁性臺架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持續(xù)去
      除上清部分。要洗凈乙醇,也可以通過將上清液倒入其他容器來去除。
      B/F分離時推薦使用對應于微型試管的磁性臺架,但也可使用簡易臺式離心機,用大約6,000r.p.m程度,5sec.的離心進行分離。g會根據(jù)離心機的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化,故請調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù),使得更有效地集合粒子,并保證凝結(jié)不至于過度。
      5) 請參照3.的表。
      6) 回收液中混入少量磁珠并不會有礙下一次的反應,但在測定吸附
      度等場合時,請通過瞬時高速離心除去磁珠。
       
      3.關(guān)于工序的省略,純化規(guī)模
      ·洗凈工序,加熱工序可以省略(請參照下表)
      用途
      洗凈
      干燥
      備注
      洗凈液*
      75%乙醇溶液
      連接反應, 測序等
      1
      1
      標準操作程序。
      鹽的混入會產(chǎn)生影響的場合
      1
      2
      吸附液和洗凈液中含有高濃度的鹽分。
      乙醇的混入會產(chǎn)生影響的場合
      1
      1次(2次)
      55℃,5min
      用于容易受乙醇影響的前處理。
      要通過吸光度來準確定量核酸濃度的場合
      1
      2
      吸附液內(nèi)含有吸收紫外線的物質(zhì)。
      *從瓊脂糖凝膠中回收核酸時,必須用洗凈液清洗。

       
      ·根據(jù)DNA溶液的量,可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
      液和磁珠的使用量。此時,無需減少75%乙醇溶液的使用量。
            
      [7] 疑難解答      
       1.回收量低
      原因
      對策
      去除乙醇不徹底
      瞬時高速離心后,請仔細去除75%乙醇溶液。
      溶出不充分
      通過10mM Tris-HCIpH8.0),或者TE buffer能夠提高溶出的效率。另外,如果加溫至55℃保持2min能夠更加有效地提高溶出效率。
      吸附時間不合適
      如果吸附過剩,回收量則會變少。最恰當?shù)奈綍r間是,對于DNA溶液為12min,對于凝膠則為2min。
      溶出時的攪拌不充分
      溶出時,如果磁珠的混合不充分,回收量會減少。在瞬時高速離心后,磁珠會在底部結(jié)塊,請仔細將其散開。特別是在從瓊脂糖凝膠中進行純化的時候,結(jié)塊的磁珠會比較難以重新散開。
      瓊脂糖凝膠的量大于0.3g
      請減少瓊脂糖凝膠的量。
      使用2%以上的瓊脂糖
      請減少瓊脂糖凝膠的量。
      沒有用洗凈液清洗
      從瓊脂糖凝膠中回收DNA時,請務(wù)必先用洗凈液清洗。
       
      2.回收的核酸的吸光度不準確
      原因
      對策
      清洗不充分
      吸附液中含有吸收紫外線的物質(zhì)。要對回收的核酸定量,請用洗凈液以及75%乙醇溶液來清洗。
      混入了吸附液
      吸附液中含有吸收紫外線的物質(zhì)。請仔細去除吸附液。用面紙等擦拭試管的蓋子上沾有的吸附液,可以有效改善狀況。
       

       
      3.回收后的核酸不能良好地進行反應
             原因
      對策
      鹽阻礙了反應
      請?zhí)砑觾纱?/span>75%乙醇溶液進行清洗的工序。吸附液和洗凈液都含有高濃度的鹽分。
      乙醇阻礙了反應
      請按照操作程序,對乙醇進行干燥處理。
      酶未能完全去除
      要去除反應液中的堿性磷酸酶等酶,請用洗凈液以及75%乙醇溶液進行清洗。
      反應用的酵素過少
      從瓊脂糖凝膠中回收核酸時,反應用的酶量應比通常要多,這樣就能得到準確良好的結(jié)果。
      使用的瓊脂糖級別不夠
      請使用高級別的瓊脂糖。
      從瓊脂糖凝膠中分離條帶時,受到的紫外線照射過多
      請用Long wave365nm附近)的紫外線來進行切片工作。
       
       
      關(guān)鍵詞: 產(chǎn)物  回收  吸附  乙醇  反應  DNA  試劑  去除  離心  進行     
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