聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg²⁺存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補，由此限定擴增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴增到10⁶倍，足夠后續(xù)實驗展開。

常見問題分析與解決方法：

1、無擴增條帶

1)酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。

2)模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。

3)變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不全。

4)反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。

5)引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。

6)引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。

7)DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

2、PCR產(chǎn)物量過少

1)退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

2)DNA模板量太少。增加DNA模板量。

3)PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

4)引物量不足。增加體系中引物含量。

5)延伸時間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時間。

6)變性時間過長。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。

3、擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散

1)酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。

2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

3)MgCl₂濃度過高�？蛇m當降低其用量。

4)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。

5)引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。

6)循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。

7)退火溫度過低。

8)電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質(zhì)量差。

9）若為PCR試劑盒則可能：

①　由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；

②　試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當。

10）降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布。

4、擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)

1)引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

2)循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

3)酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

4)退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

5)樣品處理不當。

6)Mg²⁺濃度偏高，因適當調(diào)整Mg²⁺使用濃度。

7)若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。

8)復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。

9)反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并混勻。

10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。

11)引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。

12)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。

5、陰性對照出現(xiàn)條帶

試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。

6、條帶大小與理論不符

1)污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。

2)模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。

3)基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。