色譜法是一種分離分析方法。它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異),先將它們分離,后按一定順序檢測(cè)各組分及其含量的方法。
2 色譜法的分離原理 :
當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí),就會(huì)與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等),由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異,與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同,在同一推動(dòng)力作用下,各組分在固定相中的滯留時(shí)間不同,從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異,使混合物中各組分分離的技術(shù),稱(chēng)為色譜法。
3 流動(dòng)相 ——色譜分離過(guò)程中攜帶組分向前移動(dòng)的物質(zhì)。
4 固定相 ——色譜分離過(guò)程中不移動(dòng)的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。
5 色譜法的特點(diǎn):
(1)分離效率高,復(fù)雜混合物,有機(jī)同系物、異構(gòu)體。(2)靈敏度高,可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。(3)分析速度快,一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。(4)應(yīng)用范圍廣,氣相色譜:沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無(wú)機(jī)試樣的分析。液相色譜:高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。(5)高選擇性:對(duì)性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力.。不足之處:被分離組分的定性較為困難。
6 色譜分析法的分類(lèi) :按兩相狀態(tài)分類(lèi),按操作形式分類(lèi),按分離原理分類(lèi)。
7 按兩相狀態(tài)分類(lèi) :
氣相色譜(Gas Chromatography, GC),液相色譜(Liquid Chromatography, LC),超臨界流體色譜 (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。氣相色譜:流動(dòng)相為氣體(稱(chēng)為載氣)。常用的氣相色譜流動(dòng)相有N2、H2、He等氣體,按分離柱不同可分為:填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜;按固定相的不同又分為:氣固色譜和氣液色譜。液相色譜:流動(dòng)相為液體(也稱(chēng)為淋洗液)。按固定相的不同分為:液固色譜和液液色譜。超臨界流體色譜:流動(dòng)相為超臨界流體。超臨界流體是一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展起來(lái)的一種新型的色譜分離分析技術(shù),不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的試樣組分,而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。
8 按操作形式分類(lèi) :
柱色譜(Column Chromatography, CC):固定相裝在柱管內(nèi);包括填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。紙色譜(Paper Chromatography, PC)固定相為濾紙;采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開(kāi)而進(jìn)行分離。薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC固定相壓成或涂成薄層;操作方法同紙色譜。
9 按分離原理分類(lèi) :
吸附色譜(Absorption chromatography);分配色譜(Partition Chromatography);離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography);凝膠色譜(Gel Chromatography)。
10 色譜圖 :
組分在檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間(t)所作的圖,由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況,所以又叫色譜流出曲線(xiàn)。流出曲線(xiàn)的突起部分稱(chēng)為色譜峰。
11 色譜保留值 :
色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù),它體現(xiàn)了各待測(cè)組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好,或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分,在柱中的滯留時(shí)間越長(zhǎng),或者說(shuō)將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大。所以保留值可以用保留時(shí)間和保留體積兩套參數(shù)來(lái)描述。
12 色譜圖上的色譜流出曲線(xiàn)可以說(shuō)明什么問(wèn)題 :
根據(jù)色譜峰的數(shù)目,可判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù);根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析;根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析;根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u(píng)價(jià)色譜柱的分離效能;根據(jù)兩峰間的距離,可評(píng)價(jià)固定相及流動(dòng)相選擇是否合適。
13 分配比 :
分配比是指,在一定溫度下,組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。
14 在色譜流出曲線(xiàn)上,兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù)還是擴(kuò)散速度決定?為什么?
答:分配系數(shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定,兩組分在兩相中分配系數(shù)差異越大,兩峰間的距離則相差越大,越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動(dòng)力學(xué)因素,反映在色譜流出曲線(xiàn)上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾?形狀)。
15 色譜理論需要解決的問(wèn)題 :
色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑,柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。
16 組分保留時(shí)間為何不同?色譜峰為何變寬?
組分保留時(shí)間:色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素控制;(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))。色譜峰變寬:色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制;(兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力,擴(kuò)散作用)。塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。
17 半經(jīng)驗(yàn)理論 :
將色譜分離過(guò)程比擬作蒸餾過(guò)程,將連續(xù)的色譜分離過(guò)程分割成多次的平衡過(guò)程的重復(fù)(類(lèi)似于蒸餾塔塔板上的平衡過(guò)程)。
18 塔板理論的特點(diǎn) :
塔板理論引入了塔板數(shù)和塔板高度作為柱效的衡量指標(biāo);不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同,用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí),應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì);柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果,當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí),無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大,都無(wú)法分離。
19 塔板理論的不足 :
塔板理論的基本假設(shè)不符合色譜柱的實(shí)際分離過(guò)程。塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不能說(shuō)明色譜峰為什么會(huì)展寬,同時(shí)未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。
20 速率方程:
(也稱(chēng)范第姆特方程式):H = A + B/u + C·u , H:塔板高度; u:流動(dòng)相的平均線(xiàn)速度(cm/s)。
A ─渦流擴(kuò)散項(xiàng) :A與流動(dòng)相性質(zhì)、流動(dòng)相速率無(wú)關(guān)。要減小A值,需要從提高固定相的顆粒細(xì)度和均勻性以及填充均勻性來(lái)解決。對(duì)于空心毛細(xì)管柱,A=0。固定相顆粒越小dp↓,填充的越均勻,A↓,H↓,柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕,色譜峰較窄。
B/u —分子擴(kuò)散項(xiàng) :存在著濃度差,產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬,H↑(n↓),分離變差;;分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān),流速↓,滯留時(shí)間↑,擴(kuò)散↑;擴(kuò)散系數(shù):Dg ∝(M載氣)-1/2 ; M載氣↑,B值↓。
C ·u —傳質(zhì)阻力項(xiàng) :dp↓, df↓, D ↑ ,可降低傳質(zhì)阻力。
21 H - u 曲線(xiàn)與最佳流速 :
由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用,流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值,即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)流速u(mài)作圖,曲線(xiàn)最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。
22 速率理論的要點(diǎn) :
組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因;通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔6、載氣種類(lèi)、液膜厚度及載氣流速可提高柱效;速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響;各種因素相互制約,如載氣流速增大,分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小,使柱效提高,但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大,又使柱效下降;柱溫升高,有利于傳質(zhì),但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。選擇最佳條件,才能使柱效達(dá)到最高。
23 色譜定性方法 :
1 、與標(biāo)樣對(duì)照的方法 :利用保留值定性:通過(guò)對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰,來(lái)確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。利用加入法定性:將純物質(zhì)加入到試樣中,觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。
2 、利用文獻(xiàn)保留值定性 :利用相對(duì)保留值r21定性。相對(duì)保留值r21僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定相上的保留數(shù)據(jù),可以用來(lái)進(jìn)行定性鑒定。
24 色譜定量分析 :
1 、定量校正因子:試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比,即:m i = fi’ ·Ai;絕對(duì)校正因子:比例系數(shù)fi ,單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)量:f i ’=m i / Ai;相對(duì)校正因子fi :即組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比。
2 、常用的幾種定量方法 :
( 1 )歸一化法 :特點(diǎn)及要求:歸一化法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確;進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大;僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。
(2 )外標(biāo)法 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法:特點(diǎn)及要求:外標(biāo)法不使用校正因子,準(zhǔn)確性較高,操作條件變化對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。對(duì)進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高,適用于大批量試樣的快速分析。
( 3 )內(nèi)標(biāo)法 :內(nèi)標(biāo)物要滿(mǎn)足以下要求:(a)試樣中不含有該物質(zhì);(b)與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近;(c)不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng);(d)出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分附近,且能分離開(kāi);(e)加入量適中并與待測(cè)組分接近。內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn) :內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高,操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大;每個(gè)試樣的分析,都要進(jìn)行兩次稱(chēng)量,不適合大批量試樣的快速分析;若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定,則:wi=Ai/As *常數(shù)。