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      mRNA的分離

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

      與rRNA和tRNA不同的是,哺乳動物細胞的絕大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纖維素親和層析法從大量的細胞RNA中分離mRNAdmonds等,1971;At Leder,1972)。在構建cDNA文庫時, 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA模板。
      進行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時,與總RNA相比,采用poly(A) RNA能獲得更為滿意的結果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備Oligo(dT)-纖維素,也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。
      1)用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纖維素。
      2)將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中, 柱床體積為0.5-1.0ml,用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)-纖維素最大量為10mg總RNA,如果總RNA的量較少,則應減少oligo(dT)-纖維素的使用量以防止poly(A) RNA在過柱以及后續(xù)步驟中損失。
      3)用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液
      20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
      0.5mol/L NaCl
      1mmol/L EDTA(pH8.0)
      0.1%SDS
      可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液;將適量無RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液(參見344頁)混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌,待其次序卻至65℃左右時加入已在65℃預熱30分鐘的10 %SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。
      4)用滅菌水溶解RNA,于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫,加等體積的2x層析柱加樣緩沖液,上樣,立即用滅菌的試管收集洗液。 當所的RNA溶液均進入柱床后,加1倍體積的1x層析柱加樣 ,繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級結構。
      5)當全部溶液流出后,將收集液置于65℃溫育5分鐘,重新上樣,并收集流出液。
      6)用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱,分部收集洗出液,測定每一收集管的OD260。最補由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床, OD260會很高,后來OD260值則很小或為零。在某些方案中,上述步驟后還用5倍柱術體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床,然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有, 因此這一步驟可以省略。
      7)用2-3倍柱床體積的經(jīng)滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA,以1/3-1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液
      10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
      1mmol/L EDTA(pH8.0)
      0.05%SDS
      用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理,因高壓會使溶產(chǎn)生大量氣泡。
      8)收集液置于透明的小溶器內,測定OD260, 使用前比色杯須用濃鹽酸:甲醇(1:1)浸泡1小時,再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗合并含有RNA的洗脫組分。經(jīng)上述一輪oligo(dT)-纖維素親和量層析后得到的RNA中,帶與不帶poly(A)的RNA,其含量近乎相等。如欲進一步純化mRNA,可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘,迅速冷卻至室溫,加入NaCl至終濃度為0.5mol/L,用同一oligo(dT)纖維素柱進行第二輪層析。
      9)收集oligo(dT)-纖維素柱層析的洗脫液,在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預冷的乙醇,混勻,冰浴至少30分鐘。
      10)于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly(A) RNA,小心棄去上清液,用70 %乙醇洗滌沉淀(通?床灰姵恋恚,離心片刻,在空氣中晾干核酸沉淀。
      11)用少量水重溶RNA,置于比色杯內,測定OD260, 使用前比色杯須用濃鹽酸:甲醇(1:1)浸泡1小時,再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗
      12)將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內,加3倍體積乙醇, 混勻,于-70℃保存?zhèn)溆;厥誖NA時,只需取出一小份貯存液,加3mol/K乙酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3mol/L, 混勻,用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。

       

       

       
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