一、材料
水稻葉片或小鼠肝組織。
二、設(shè)備
研缽,冷凍臺(tái)式高速離心機(jī),低溫冰箱,冷凍真空干燥器,紫外檢測(cè)儀,電泳儀,電泳槽。
三、試劑
1、無RNA酶滅菌水:用將高溫烘烤的玻璃瓶(180℃ 2小時(shí))裝蒸餾水,然后加入0.01%的DEPC(體積/體積),處理過夜后高壓滅菌。
2、75%乙醇:用DEPC處理水配制75%乙醇,(用高溫滅菌器皿配制),然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中,存放于低溫冰箱。
3、1×層析柱加樣緩沖液;20mmol/L Tris·Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS。
4、洗脫緩沖液:10mmol/L Tris·Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS。
四、操作步驟
。ㄒ唬﹦(dòng)植物總RNA提取-Trizol法
Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌,樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析,斑點(diǎn)雜交, Poly(A) 分離,體外翻譯,RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末后,再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨,注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫放置5分鐘,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒。
3、取上層水相于一新的離心管,按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘。
4、棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,渦旋混勻,4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中,必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離,或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
。ǘ﹎RNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A) ,當(dāng)總RNA流徑oligo(dT)纖維素時(shí),在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上,在低鹽濃度或蒸餾水中,mRNA可被洗下,經(jīng)過兩次oligo(dT) 纖維素柱,可得到較純的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床體積為0.5-1.0ml,用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。
3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
4、將(一)中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫,加入等體積2x柱層析緩沖液,上樣,立即用滅菌試管收集洗出液,當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后,加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。
5、測(cè)定每一管的OD260,當(dāng)洗出液中OD為0時(shí),加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液,以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
6、測(cè)定OD260,合并含有RNA的洗脫組分。
7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍體積的冰冷乙醇, 混勻, -20℃30分鐘。
8、4℃下12000g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗 滌沉淀,4℃下12000g離心5分鐘。
9、小心棄去上清液,沉淀空氣干燥10分鐘,或真空干燥10分鐘。
10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃)。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈,然后用層析柱加樣緩沖液平衡,并加入0.02%疊氮鈉(NaN3)冰箱保存,重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。