(1)石蠟切片脫蠟入水后,置0.1mol/l PBS pH7.2沖洗5min;冰凍切片直接入PBS沖洗5min。
。2)0.1mol/l 甘氨酸PBS沖洗5min。
。3)0.4%Trition X-100 PBS 沖洗15min。
。4)蛋白酶K1μg/ml(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保溫30min。
。5)4%多聚甲醛PBS固定5min。
(6)0.1mol/l PBS沖洗2×3min。
(7)0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
。8)2×SSC沖洗10min(1×SSC:0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 檸檬酸鈉)。
。9)取10μl含相應(yīng)探針的雜交液滴于標(biāo)本上,如果是cDNA探針則用前將探針于95℃水浴中保溫10min,馬上放入冰浴中冷卻,然后再用。
。10)蓋上22×22mm的硅化蓋片或合適大小的蠟?zāi)ぃ霚睾?3℃保溫12~16h。
。11)4×SSC洗脫蓋片,并在同一液中37℃漂洗10~30min。
(12)2×SSC(含20μg/mlRNaseA, 適于RNA探針)沖洗30min,37℃。
。13)1×SSC,0.1×SSC,37℃各漂洗10~30min。
。14)0.05mol/l PBS 沖洗4×5min。
。15)3%BSA(0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保溫30min。
。16)Avidin –AKP(堿性磷酸酶)(1:500~1:100,0.4%Triton X-100 PBS配)室溫1~3h。
。17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
。18)TSM1沖洗2×5min。
。19)TSM2沖洗2×5min。
。20)硝基四氮唑藍(lán)(NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)0.2mg/ml混合液顯色,室溫,暗處3h。
。21)20mmol/l EDTA,pH8.0終止顯色。
。22)甘油明膠直接封片。
。2)0.1mol/l 甘氨酸PBS沖洗5min。
。3)0.4%Trition X-100 PBS 沖洗15min。
。4)蛋白酶K1μg/ml(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保溫30min。
。5)4%多聚甲醛PBS固定5min。
(6)0.1mol/l PBS沖洗2×3min。
(7)0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
。8)2×SSC沖洗10min(1×SSC:0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 檸檬酸鈉)。
。9)取10μl含相應(yīng)探針的雜交液滴于標(biāo)本上,如果是cDNA探針則用前將探針于95℃水浴中保溫10min,馬上放入冰浴中冷卻,然后再用。
。10)蓋上22×22mm的硅化蓋片或合適大小的蠟?zāi)ぃ霚睾?3℃保溫12~16h。
。11)4×SSC洗脫蓋片,并在同一液中37℃漂洗10~30min。
(12)2×SSC(含20μg/mlRNaseA, 適于RNA探針)沖洗30min,37℃。
。13)1×SSC,0.1×SSC,37℃各漂洗10~30min。
。14)0.05mol/l PBS 沖洗4×5min。
。15)3%BSA(0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保溫30min。
。16)Avidin –AKP(堿性磷酸酶)(1:500~1:100,0.4%Triton X-100 PBS配)室溫1~3h。
。17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
。18)TSM1沖洗2×5min。
。19)TSM2沖洗2×5min。
。20)硝基四氮唑藍(lán)(NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)0.2mg/ml混合液顯色,室溫,暗處3h。
。21)20mmol/l EDTA,pH8.0終止顯色。
。22)甘油明膠直接封片。