亞克隆的基本過程包括:(1)目的DNA片段和載體的制備;(2)目的DNA片段和載體的連接;(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化;(4)重組子篩選。
一、試劑準(zhǔn)備
1.LB液體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨(細(xì)菌培養(yǎng)用)10g,酵母提取物(細(xì)菌培養(yǎng)用) 5g,NaCl 10g,加ddH2O 至1000ml,完全溶解,分裝小瓶,15lbf/in2高壓滅菌20min。
2.1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100ml LB,15 lbf/in2 高壓滅菌20min,稍冷卻,制備平皿。
3.IPTG、X-Gal
4.0.1M MgCl2 :15 lbf/in2高壓滅菌20min,0℃冰浴備用。
5.0.1M CaCl2(以20%甘油水溶液配制):15 lbf/in2高壓滅菌20min,0℃冰浴備用。
6.限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶。
二、目的DNA片段和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶,消化已知目的DNA和載體,獲得線性DNA,用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況,選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈,分別產(chǎn)生對(duì)稱性粘性末端(用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端)、不對(duì)稱粘性末端(用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端)、平端。在亞克隆時(shí),首選不對(duì)稱相容末端連接,次選對(duì)稱性粘性相容性末端連接,由于平末端連接效率較低,通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ,一般先將不匹配末端補(bǔ)平,然后再以平末端連接。
三、利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接
(一)連接要求和結(jié)果
外源DNA片段末端性質(zhì)
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連接要求
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連接結(jié)果
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不對(duì)稱粘性末端
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兩種限制酶消化后,需純化載體以提高連接效率
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)常可保留;非重組克隆的背景較低;外源DNA可以定向插入到載體中。
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對(duì)稱性粘性末端
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線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)?杀A;重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;外源DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體中。
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平端
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要求高濃度的DNA和連接酶
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載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)消失;重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;非重組克隆的背景較高 。
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帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應(yīng)時(shí),外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此,必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA 的濃度,以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平,此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接反應(yīng),也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸(未脫磷),可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵;如載體DNA已脫磷,則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵,此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口,在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。
(二)T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案
1.連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
2.10μl體積反應(yīng)體系中:取載體50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子(一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1∶1-1∶5),補(bǔ)足ddH2O 至8μl。
3.輕輕混勻,稍加離心,56℃水浴5min后,迅速轉(zhuǎn)入冰浴。
4.加入含ATP的10×Buffer 1μl,T4 DNA連接酶合適單位, 用ddH2O 補(bǔ)至10μl,稍加離心,在適當(dāng)溫度(一般14-16℃水浴)連接8-14hr。
四、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
1.感受態(tài)細(xì)胞的制備
⑴ 保存于-70℃的DH5α(或其他菌種)用接種環(huán)劃菌于1.5%瓊脂平板上,37℃恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(約14-16 hr)。
⑵ 挑取單菌落,接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫,250g振蕩培養(yǎng)過夜(約12hr)。
⑶ 取0.5ml 過夜培養(yǎng)液,接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5hr,至OD600為0.4-0.5時(shí),放置于4℃冰箱冷卻1-2hr。
(注:以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。)
⑷ 將培養(yǎng)液分入兩個(gè)50ml離心管中,4℃離心,4000g×10min,棄去上清,用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30min。
⑸ 4℃離心,4000g×10min,棄去上清,加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。
⑹ 以100μl/管分裝入1.5ml離心管中,-70℃凍存?zhèn)溆谩?br />注:此法制備感受態(tài)細(xì)胞,可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5×106-2×107個(gè)菌落,這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要,制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃,但保存時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響,一般三個(gè)月以內(nèi)轉(zhuǎn)化效率無多大改變。
2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌,冰浴化開;
⑵ 加入適量連接產(chǎn)物(一般不超過10μl,輕輕混勻,冰浴20min;
⑶ 于42℃熱休克90s,迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中,繼續(xù)冰浴2-3min;
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl,于37℃緩搖孵育45min;
⑸ 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板(根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG),待膠表面沒有液體流動(dòng)時(shí),37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。
五、重組子的篩選
根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補(bǔ)、抗生素基因等,F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時(shí)存在時(shí),可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ),稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ 細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落,因而易于識(shí)別。然而,當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后,幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后,有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。
六、注意事項(xiàng)
1. 目的DNA片段制備、回收、純化時(shí),應(yīng)避免外來DNA污染。
2. 不同廠家生產(chǎn)的T4 DNA連接酶反應(yīng)條件稍有不同,但其產(chǎn)品說明書上均有最適反應(yīng)條件,包括對(duì)不同末端性質(zhì)DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連接酶緩沖液(10×、5×、2×),其中多已含有要求濃度的ATP,應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融使其分解。
2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力,因此可將上述連接產(chǎn)物通過熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí),導(dǎo)入的重組DNA也得到增殖。
3. 制備感受態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的,15 lbf/in2高壓滅菌20min。
5. 白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過鑒定。