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      Southern印跡雜交

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

        Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術(shù),在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標本用限制性內(nèi)切酶消化后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段,然后經(jīng)堿變性,Tris緩沖液中和,高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上,烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交,利用放射自顯影術(shù)確定探針互補的每條DNA帶的位置,從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

       。1)瓊脂糖凝膠電泳:利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段(0.3~25kb)分離開。分離大分子DNA片段(800~12000bp)用低濃度瓊脂糖(0.7%),分離小分子片段(500~1000bp)用高濃度瓊脂糖(1.0%),300~5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠,根據(jù)分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同,可選用不同規(guī)格的電泳槽。
        電泳時,同時將標記物加到旁邊孔中,便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜。電泳畢,將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min,也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中,在254nm短波透射燈下拍照,加橙黃色濾色鏡,使用高速一次成像膠片,光圈f4.5,曝光20~40s。
       。2)硝酸纖維素濾膜吸印。
        ①將膠切成合適大小,切去右上角作為記號。
       、趯⒛z放進盛有變性緩沖液(1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH)的盤中輕搖動15min。
       、蹞Q到中和緩沖液(1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl)中輕搖動30min。
       、懿靡粡埾跛崂w維素膜,2~4張3MM濾紙和一些吸印紙(可用衛(wèi)生紙),都與膠的大小相同(硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大,否則易形成旁路),先將硝酸纖維素膜浸到水中,再放入10×SSC中,接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴橡膠手套操作。
       、萜奖P上放一塊比膠大的平板(盛膠槽翻過來即可),上面鋪一張3MM濾紙,起燈芯作用,盤中加少量10×SSC緩沖液(2.5cm厚),不能沒過平板,使3MM濾紙充分飽和。
        ⑥將膠倒扣到3MM濾紙上。
       、呓䴘竦南跛崂w維素鋪在膠上,對齊,鋪膜時從一邊逐漸放下,防止產(chǎn)生氣泡,有氣泡時,可用吸管趕出,不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。
        ⑧膜上放一張3MM濾紙,不能與膠接觸。
       、嵘厦婕游〖埣爸匚铮500g左右)。
       、馔ㄟ^濾紙的灶芯作用,平盤中的緩沖液就會通過膠上移,從而將DNA吸印到膜上,及時更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉(zhuǎn)印過夜。
       、先コ厦娴臇|西,用鑷了將膜取出,在6×SSC中洗一下(也可不洗)。
        ⑿自然干燥,80℃烤2h。
        ⒀這時的膜就可進行雜交,或室溫密封保存。

       

       

       
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