。1)將200mg組織在冰浴條件下用消毒剪刀充分剪碎,加4ml 1×RSB緩沖液(10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml帶蓋的塑料管中。
。2)加SDS至濃度為1%(可加0.4ml10%SDS),混勻。由于DNA從核中釋放出來(lái),樣品變得粘稠。
。3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,終濃度為100μl/ml,37℃保溫1~3d,直到組織完全解體。中間可振動(dòng)樣品管幾次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(4)用等體積飽和酚、1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿-異戊醇及等體積氯仿-異戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm離心5min,用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相。
。5)加2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纖維絲狀的大片段DNA,并移入一新管,吸干DNA中的無(wú)水乙醇。
。6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中,4℃過(guò)夜可作進(jìn)一步純化。
。7)加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保溫5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(8)同上法用飽和酚、氯仿-異戊醇抽提,乙醇沉淀離心,棄上清。
(9)75%乙醇洗滌2次,離心,棄上清,真空抽干。適量1×TE溶解,保存在4℃。
。2)加SDS至濃度為1%(可加0.4ml10%SDS),混勻。由于DNA從核中釋放出來(lái),樣品變得粘稠。
。3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,終濃度為100μl/ml,37℃保溫1~3d,直到組織完全解體。中間可振動(dòng)樣品管幾次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(4)用等體積飽和酚、1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿-異戊醇及等體積氯仿-異戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm離心5min,用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相。
。5)加2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纖維絲狀的大片段DNA,并移入一新管,吸干DNA中的無(wú)水乙醇。
。6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中,4℃過(guò)夜可作進(jìn)一步純化。
。7)加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保溫5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(8)同上法用飽和酚、氯仿-異戊醇抽提,乙醇沉淀離心,棄上清。
(9)75%乙醇洗滌2次,離心,棄上清,真空抽干。適量1×TE溶解,保存在4℃。