先取少量純化的重組質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶切出目的基因,經(jīng)電泳分離,確認(rèn)。以200μl含2mg DNA(重組質(zhì)粒)為例:取10μl含100μg DNA,加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性內(nèi)切酶,1/10體積緩沖液,1-2小時(shí)保溫。緩沖液種類和酶反應(yīng)溫度因內(nèi)切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc,2倍無(wú)水乙醇,-70℃,2小時(shí)(-20℃過(guò)夜),10000rpm,10分鐘離心,棄上清液(乙醇沉淀)。適量TE溶解沉淀(切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物),電泳分離(用相應(yīng)分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)電泳),在紫外光下觀察結(jié)果,與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較,確認(rèn)目的基因和內(nèi)切酶的切割效果。
經(jīng)電泳確認(rèn)后,取適量DNA(重組質(zhì)粒)同上條件切開(kāi),用1.5%低熔點(diǎn)(<65℃熔解)瓊脂糖凝膠,電泳分離。在紫外光下,切出含目的基因區(qū)帶(凝膠),放入離心管中,提取純化。
從低熔點(diǎn)凝膠提取,純化DNA片段。加與凝膠體積相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA),置65℃水浴5分鐘保溫,使凝膠完全溶解。待放至室溫,加等量酚(TE飽和,TE封在上層,取下層酚),輕輕混勻(不用混勻),12000rpm,3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液,加0.1體積3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無(wú)水乙醇,進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解,測(cè)定含量,備用(可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析,探針制備等)。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外,如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳,離心管低部加玻璃棉,高速離心等方法回收DNA片段。
經(jīng)電泳確認(rèn)后,取適量DNA(重組質(zhì)粒)同上條件切開(kāi),用1.5%低熔點(diǎn)(<65℃熔解)瓊脂糖凝膠,電泳分離。在紫外光下,切出含目的基因區(qū)帶(凝膠),放入離心管中,提取純化。
從低熔點(diǎn)凝膠提取,純化DNA片段。加與凝膠體積相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA),置65℃水浴5分鐘保溫,使凝膠完全溶解。待放至室溫,加等量酚(TE飽和,TE封在上層,取下層酚),輕輕混勻(不用混勻),12000rpm,3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液,加0.1體積3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無(wú)水乙醇,進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解,測(cè)定含量,備用(可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析,探針制備等)。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外,如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳,離心管低部加玻璃棉,高速離心等方法回收DNA片段。