1 質(zhì)粒DNA的提取
質(zhì)粒DNA是細(xì)菌細(xì)胞中小的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA。由于基因工程中使用的載體主要是質(zhì)粒,因此,質(zhì)粒DNA的提取和純化是進(jìn)行基因工程的重要前提。提取質(zhì)粒DNA的方法很多,下面介紹幾種有代表性的程序。
1)酚提取法
2)堿提取法 其基本原理是在溶菌酶和SDS破壁釋放DNA后,在強(qiáng)堿條件下,DNA變性成單鏈,當(dāng)加醋酸鈉(NaAc)適當(dāng)中和pH時(shí),質(zhì)粒DNA復(fù)性;而Ch-DNA和大分子RNA仍為單鏈并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物被高鹽沉淀,質(zhì)粒DNA留在溶液中。不需經(jīng)酚氯仿抽提,即可直接用乙醇沉淀上請中的p-DNA)。
3)煮沸提取法 此法快速簡便,既可小規(guī)模檢驗(yàn)也可大規(guī)模制備質(zhì)粒DNA。其基本原理是在溶菌酶和Triton破壁釋放DNA后,迅速煮沸,使Ch-DNA和蛋白質(zhì)沉淀,質(zhì)粒DNA留在溶液中。
2 質(zhì)粒DNA的純化(PCR產(chǎn)物的純化)
(1)加入0.1倍體積的10×STE緩沖液
⑵ 加入等體積的4 mol/L NH4Ac
⑶ 加入2.5倍體積室溫放置的無水乙醇
⑷ 立即在室溫下12 000r/min, 離心10 min,使DNA沉淀,小心地去掉上清
⑸ 加入200μl的70%(V/V)乙醇
⑹ 室溫下12 000r/min, 離心10 min,小心地去掉上清,干燥
⑺ 用與原樣品體積相等(或減小體積以使樣品濃縮)的TE緩沖液重懸DNA,放置4℃待用, 或-20℃貯存。
質(zhì)粒DNA是細(xì)菌細(xì)胞中小的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA。由于基因工程中使用的載體主要是質(zhì)粒,因此,質(zhì)粒DNA的提取和純化是進(jìn)行基因工程的重要前提。提取質(zhì)粒DNA的方法很多,下面介紹幾種有代表性的程序。
1)酚提取法
2)堿提取法 其基本原理是在溶菌酶和SDS破壁釋放DNA后,在強(qiáng)堿條件下,DNA變性成單鏈,當(dāng)加醋酸鈉(NaAc)適當(dāng)中和pH時(shí),質(zhì)粒DNA復(fù)性;而Ch-DNA和大分子RNA仍為單鏈并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物被高鹽沉淀,質(zhì)粒DNA留在溶液中。不需經(jīng)酚氯仿抽提,即可直接用乙醇沉淀上請中的p-DNA)。
3)煮沸提取法 此法快速簡便,既可小規(guī)模檢驗(yàn)也可大規(guī)模制備質(zhì)粒DNA。其基本原理是在溶菌酶和Triton破壁釋放DNA后,迅速煮沸,使Ch-DNA和蛋白質(zhì)沉淀,質(zhì)粒DNA留在溶液中。
2 質(zhì)粒DNA的純化(PCR產(chǎn)物的純化)
(1)加入0.1倍體積的10×STE緩沖液
⑵ 加入等體積的4 mol/L NH4Ac
⑶ 加入2.5倍體積室溫放置的無水乙醇
⑷ 立即在室溫下12 000r/min, 離心10 min,使DNA沉淀,小心地去掉上清
⑸ 加入200μl的70%(V/V)乙醇
⑹ 室溫下12 000r/min, 離心10 min,小心地去掉上清,干燥
⑺ 用與原樣品體積相等(或減小體積以使樣品濃縮)的TE緩沖液重懸DNA,放置4℃待用, 或-20℃貯存。