(一)聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒DNA
這里介紹的方法(R.Tresman,個人通訊)已卓有成效地用于純化堿裂解法制備的質(zhì)粒DNA。
1)將核酸溶液[上頁步驟9)所得]轉(zhuǎn)入15mlCorex 管中, 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液,充分混勻,用Sorvall SS34 轉(zhuǎn)頭(或與其相當?shù)霓D(zhuǎn)頭)于4℃下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。
2)將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi),加等量的異丙醇, 充分混勻,用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭(或與其相當?shù)霓D(zhuǎn)尖)于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧, 回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞開管口,將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁,流盡乙醇,用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞開管口并將管侄置,在紙巾上放置幾分鐘,以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
4)用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中,于室溫放置30分鐘。
5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量離心機于4℃以12000g離心5分鐘,以回收質(zhì)粒DNA。
6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
7)將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中,加100μl 10mol/L乙醇銨,充分混勻,加2倍體積(約1ml)乙醇,于室溫放置10分鐘,于4℃以12 000g離心5分鐘,以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。
8)吸去上清,加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。
9)吸去上清,敞開管口,將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
10)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀釋[用TE(pH8.0)] 后測量OD260,計算質(zhì)粒DNA的濃度(1OD260=50μg質(zhì)粒DNA/ml), 然后將DNA貯于-20℃。
(二)氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA
1.連續(xù)梯度
1)測量DNA溶液的體積,按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl, 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
2)每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液(10mg/ml溶于水);立即將溴化乙錠溶液(漂浮在表成)與DNA-氯化銫溶液混勻, 溶液的終密度應(yīng)為1.55g/ml(溶液的折射率為1.3860)溴化乙錠濃度應(yīng)為大約740μg/ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)(如用錫箔完全包裹的瓶子)。于室溫保存。
3)于室溫用Sorvall SS34頭(或與其相當?shù)霓D(zhuǎn)頭)以8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘, 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的復(fù)合物。
4)用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到適用于Beckman Ti65重直轉(zhuǎn)頭或Ti50、Ti65或Ti70 角轉(zhuǎn)頭(或與它們相當?shù)霓D(zhuǎn)頭)
的離心管(Beckman Quick-seal或與之相當?shù)碾x心管)中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。
5)于20℃對所得的密度梯度以45 000轉(zhuǎn)/分離心16小時(VTi65 轉(zhuǎn)頭)、 以45 000轉(zhuǎn)/分離心48小時(Ti50轉(zhuǎn)頭)、以60 000轉(zhuǎn)/分離心24小時(Ti65轉(zhuǎn)頭)或者以60 000轉(zhuǎn)/分離心24小時(Ti70.1轉(zhuǎn)頭)。在普通光照下,在梯中心可見兩條DNA區(qū)帶, 上部區(qū)帶材料通常較少,由線狀的細菌(染色體)DNA和帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA組成:下部區(qū)帶則由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠RNA復(fù)合物,位于CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質(zhì)。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl-溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質(zhì)粒DNA而不至超負荷。如有更大量的質(zhì)粒存在,將擴展為一條寬帶,并與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質(zhì)粒復(fù)制達到極高水平時才會出現(xiàn),只要將該質(zhì)粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現(xiàn)負荷,可收集整個DNA區(qū)高水平時才會出現(xiàn),只要產(chǎn)將該質(zhì)粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現(xiàn)超負荷,可收集整個DNA區(qū)帶,用CsCl溶液(ρ=1.58g/ml)將體積調(diào)到15ml,在兩個離心管中再度離心,使DNA達到平衡。
6)收集DNA帶。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入,為盡量減少污染的機會,首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶(雜色體DNA):用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂,然后用一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭(其斜面向上)斤插入管中,以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體DNA區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內(nèi),用造型粘土塊封信皮下注射針頭的未端并將第2根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第3根皮下注射針頭(18號),將下部的質(zhì)粒DNA區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。
2.不連續(xù)梯度
該方法是將含不同濃度CsCl的溶液分層加到離心管中,這樣可以加速CsCl梯度的形成,使離心時間減少到6小時。
1)將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中,制成CsCl溶液(ρ=1.47g/ml)。
2)將8ml氯化銫溶液加到Beckman Quick-Seal 離心管(或與其相當?shù)墓埽┲,擱置一旁等步聚8)使用。
3)如有必要,可酌情用TE(pH8.0)將質(zhì)粒DNA溶液的體積精確地調(diào)到3ml。
4)在質(zhì)粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30℃以促進鹽溶解, 小心地混勻溶液直至鹽溶解。
5)稱量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達13.2g,用天平稱量時應(yīng)注意去除管的重量。
6)加入0.8ml溴化乙錠溶液(10mg/ml溶于水),快速混勻溶液直至染料均勻地分散,此時溶液瓣體積應(yīng)大約為7.5ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)于室溫貯存在避光容器中(如完全用錫箔包裹的瓶子)。小心:溴化乙錠是一咱強誘變劑,并在中度毒性。
接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。
7)于室溫用Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭(或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)法)以8000轉(zhuǎn)/ 分離心5分鐘,浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的復(fù)合物。
8)將-22.86cm的巴期德吸管放入裝有步驟2)制備的CsCl的離心管中, 吸頭應(yīng)接觸管底。用吸管小心地將步驟7所制備的清亮紅色溶液(來自浮渣之下)加入管內(nèi),使樣本層位CsCl溶液(1.47g/ml)之下。如有必要,可酌情步驟1)中制備的CsCl溶液(ρ=1.47g/ml)添滿離心管,封口。
9)將封口的管,(與相應(yīng)的平衡管一起)放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13轉(zhuǎn)頭(或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭中),于20℃以60 000轉(zhuǎn)/分將密度梯度離心6小時。
10)回收閉環(huán)質(zhì)粒DNA區(qū)帶
(三)從經(jīng)過純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠
下面方法對于從經(jīng)過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心純化的DNA中去除溴化乙錠都同樣奏效。
方法:有機溶劑抽提
小心:溴化乙錠是一種強誘變劑,并有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。用后這些溶液應(yīng)用后述的方法進行凈化處理。
1)將DNA溶液放入玻璃或塑料管中,加等體積的水飽和1-丁醇或異戊醇。
2)振蕩混合兩相。
3)用臺式離心機于室溫以1500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘。
4)用巴期德吸管將下層水相移至一干凈的玻璃或塑料管內(nèi)。
5)反復(fù)抽提[步驟1)-4)]4-6次直到粉紅色從水相和有機相中均消失。
6)用以下任意一種方法從DNA溶液中除CsCl:通過微量濃縮器(Amicon)進行旋轉(zhuǎn)透析,對TE(pH8.0)透析24-48小時,并換液數(shù)次或者用3倍體積水進行稀釋并于4℃用2倍體積乙醇(即終體積相當于原未稀釋體積的6倍)沉淀D15分鐘,再于4℃以10 000g 離心15 分釧, 將沉淀的DNA溶于約1ml TE(pH8.0)中。如將DNA的乙醇溶液置于-20℃,CsCl會沉淀。
7)測定DNA終溶液的OD260值,計算DNA的濃度, 將DNA分成小份貯存于-20℃。如果終制備的DNA含有顯著量的溴化乙錠(依顏色判斷),可用酚、酚:氯仿各抽提1次,然后用乙醇沉淀DNA。
(四)溴化乙錠溶液的凈化處理
小心:溴化乙錠是強誘變劑,并有中度毒性,取用含有這一染料的溶液時務(wù)必戴上手套,這些溶液經(jīng)使用應(yīng)按下面介紹的方法進行凈化處理。
1.溴化乙錠濃溶液(即濃度>0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液)的凈化處理
方法: 用少門氏菌-微粒體測定表明, 本方法(Lunn 和Sanaone,1987)可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。
1)加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。
2)加入0.2體積新配制的5%次磷酸和0.12體各新配制的0.5mol/L 亞硝酸鈉,混勻。
切記:檢測該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50%溶液,具有腐蝕性,應(yīng)小心操作,必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液(0.5mol/L)應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml,現(xiàn)用現(xiàn)配。
3)于室溫溫育24小時后,加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些, 該溶液可予丟棄。返回
切記:檢測該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50%溶液,具有腐蝕性,應(yīng)小心操作,必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液(0.5mol/L)應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml,現(xiàn)用現(xiàn)配。
3)于室溫溫育24小時后,加入大大過量的1ml/L碳酸氫鈉。至些, 該溶液可予丟棄。
(五)從質(zhì)粒DNA制品中去除RNA
對于某些用途(例如用BAL31進生活化或用T4噬菌體多核苷酸激酥標記質(zhì)粒DNA的限制切片段的5'端),必須獲得無RNA污染的DNA制品。盡管在通過氯化銫-化乙錠梯度平衡離心所制備的質(zhì)粒DNA中,這樣的RNA污染物的重量微不卟道,但對說來,其中的RNA分子數(shù)卻可能相當可觀,并可在限制酶消化反應(yīng)的全部5'端中占據(jù)砂容忽視的比例。通過下述方法,可以從質(zhì)粒制品中去除RNA 。
2.通過Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B進行層析
1)制備質(zhì)粒DNA。
2)有等體積的經(jīng)TE(pH8.0)平衡后的酚抽提1次。
3)將至多1ml的水相鋪在經(jīng)TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
4)將DNA裝入層柱并在柱的上部連接上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的貯液瓶,立即開始以0.5ml流出液為1流進行收集。
5)當收集到15份時,關(guān)閉柱底部,為明確質(zhì)粒DNA的分布情況,可心眾每份收集物中取10μg樣品,通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳或溴化乙錠熒光(見附錄E)進行分析。
6)將含質(zhì)粒DNA的組成合并在一起,加2倍體積的乙醇于4℃沉淀10分鐘,然后于4℃以大于10 000g離心15分鐘,以回收DNA。