（一）細菌的收獲和裂解

１．收獲
１）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
３）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
１．收獲
１）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
３）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。

３．煮沸裂解
該法根據(jù)Ｈolmex和Quigley(1985)的方法改進而成。
１）將細菌沉淀[收獲細菌和步驟３）所得]重懸于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaC
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩３秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。
３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。
４）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。
５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置５分鐘。
７）用微量離心機于4℃以12 000g離心５分種，回收核酸沉淀。
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。
９）加1ml７０％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
10）按步驟８）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（２－５）分鐘。
11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
i．當(dāng)從表達內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA 株，如HB101 ）中小量制粒ＤＮＡ?xí)r，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能完全滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Ｍg2 存在下溫育（Ｖ中用限制酶時）質(zhì)粒ＤＮＡ可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。
ii．此法制備的高考貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3哉pＵＣ），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細菌增減物３－５μg。
iii．如果要通過限酶切割反應(yīng)來分析ＤＮＡ，可�。�μlＤＮＡ溶液加到另一個含８μl水的微量離心管內(nèi)，加１μl 10x限制酶緩沖液和１單位所需限制酶，在適宜溫度溫育１－２小時。將剩余的ＤＮＡ貯存于－20℃。通過凝膠電泳分析經(jīng)限制酸消化的ＤＮＡ片段。如果小量制備的ＤＮＡ不被限制酶切開，很有可能在收獲細菌的步驟３）或上述步驟８）未能很好地去除所有液體。這種情況下，可用酚：氯仿抽提ＤＮＡ終產(chǎn)物，然后用乙醇重新沉淀ＤＮＡ，通常，用5－10倍過量的酶（特別是并不昂貴的酶）在100-200μl 體積中進行消化，可以克服限制酶切割反應(yīng)遇到切割反應(yīng)遇到的困難。消化后， 加0. 1 體積3mol/L乙酸鈉（pH5.2)和２倍體積乙醇沉淀ＤＮＡ。

（二）質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策

　　裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：
１）有些工作者首次進行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化ＤＮＡ。
２）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質(zhì)粒ＤＮＡ的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。