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      轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
      (一)原理
      轉(zhuǎn)移電泳是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出的蛋白質(zhì)譜直接轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,而形成固定相,并同時(shí)排除各種干擾物質(zhì),保持其天然構(gòu)象和生物學(xué)活性,完成在凝膠中難以進(jìn)行的各種生物試驗(yàn)。
      (二)材料
      1.瓊脂糖
      2.丙烯酰胺
      3.甲叉雙丙烯酰胺
      4.十二烷基磺酸鈉(SDS)
      5.硝酸纖維膜濾紙 孔徑0.45μm
      6.瓊脂糖凝膠電泳緩沖液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA(pH8.3)。
      7.SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1%SDS(pH8.3)。
      8.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20%甲醇(pH8.3)。
      9.溴乙啶溶液 稱(chēng)取5mg溴乙啶,用無(wú)離子水溶解。定容到10ml,取1ml稀釋到1 000ml,最終濃度為0.5ug/ml。
      10.考馬斯亮蘭R-250染色液 0.25%考馬斯亮蘭R-250-10%醋酸-45%甲醇。
      11.氨基黑染色液 在含10%醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至飽和。
      12.垂直板型及水平板型凝膠電泳槽
      13.轉(zhuǎn)移電泳槽
      14.直流穩(wěn)壓電源0V~800V,0mA~100mA
      (三)操作方法
      1.SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳(垂直板型)分離蛋白質(zhì)。
      ⑴凝膠的制備:
      丙烯酰胺 15.00g
      甲叉雙丙烯酰胺 0.40g
      0.37Mol/L Tris—HCl(pH8.3) 50ml
      此為丙烯酰胺母液,過(guò)濾后4℃保存?zhèn)溆谩?br />丙烯酰胺母液 8.30ml
      N、N、N、N—四甲基乙二胺(DEMED) 250ul
      10%SDS 0.25ml
      0.375Mol/L pH8.8 Tris-HCl 16.45ml
      混合即為10%分離膠。
      丙烯酰胺母液 1.30ml
      TEMED 15.00ul
      10%SDS 0.10ml
      0.125Mol/L pH6.8Tris-HCl 8.60ml
      制成4%濃縮膠。
      將分離膠與濃縮膠真空抽氣10min~15min,備用。
      ⑵凝膠板的制備及加樣:取1%的瓊脂將凝膠膜底部的縫隙封固。在10%的分離膠中加入10%過(guò)硫酸銨0.25ml,混勻后,立即沿玻璃壁緩緩加入膠膜中,上端留出5cm的高度,然后用帶有細(xì)針頭的注射器輕輕地向膠面加入蒸餾水,靜置數(shù)分鐘,水膠界面消失,約20min~30min界面清晰(凝膠已聚合),用注射器將水吸出,并用濾紙吸干余水。在4%濃縮膠中加入10%過(guò)硫酸銨0.4ml,混勻后,沿玻璃壁緩慢倒入已聚合的分離膠的上面,立即插進(jìn)樣品槽模板。待凝膠聚合后(約20min~30min),輕輕拔出樣品槽模板。將電泳緩沖液加入上、下電泳槽。
      將分離的蛋白質(zhì)樣品用0.01Mol/L Tris-HCl(pH8.0)-0.001Mol/L EDTA-1%SDS-5%硫基乙醇溶液作1︰1稀釋?zhuān)?00℃加熱處理3min之后,加入甘油10%及適當(dāng)量溴酚蘭,用微量注射器將樣品注入樣品槽中,蛋白質(zhì)最后濃度一般為0.05mg/ml~1mg/ml。
      ⑶電泳:上端接陰極,下端接陽(yáng)極。電壓120V、電流30mA,電泳時(shí)間5h~6h,待染料泳至距底部約1cm處時(shí)斷電。
      ⑷染色:切下一部分凝膠,用考馬斯亮蘭R-250染色作為對(duì)照。其余部分作轉(zhuǎn)移電泳。
       

       

       
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