一、引言
基因治療是指改變細(xì)胞遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的醫(yī)學(xué)治療。目前僅限于體細(xì)胞。
基因治療的技術(shù)和方式日趨多樣性。按基因?qū)氲男问,分為體外基因?qū)耄╡xvivo)及體內(nèi)基因?qū)耄╥nvivo)兩種形式。前者是在體外將基因?qū)肴思?xì)胞,然后將該細(xì)胞注入人體。其制品形式是外源基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,適合在具有專門技術(shù)人才和GMP條件的醫(yī)療單位進(jìn)行。后者則是將基因通過適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入系統(tǒng)直接導(dǎo)入人體,包括病毒的與非病毒的方法。其制品形式是基因工程技術(shù)改造的病毒或者是重組DNA、或者是DNA復(fù)(混)合物;蛑委熤苿┓N類較多,因此,本指導(dǎo)原則不可能用一個模式來概括,只能提出一個共同的原則,具體的方案應(yīng)根據(jù)這些原則,確定研究技術(shù)路線。其基本原則:一是必須確保安全與有效,要充分估計可能遇到的風(fēng)險,并提出相應(yīng)的質(zhì)控要求;二是要促進(jìn)基因治療的研究,并加強(qiáng)創(chuàng)新。對一些新的治療技術(shù)路線的相應(yīng)質(zhì)控要求,可有一定的靈活性,應(yīng)注意到基因治療本身的特點(diǎn)以及它與經(jīng)典的化學(xué)合成藥物或基因工程藥物的差別。目前,一些基因治療研究相對比較成熟,而一些則不夠完善,更加要求研究者在使用該技術(shù)指導(dǎo)原則時不可生搬硬套。為此,研究者應(yīng)加強(qiáng)咨詢和論證,提出一個科學(xué)可行的研究方案,最終獲得確保安全有效的基因治療制品。
在向國家藥品監(jiān)督管理局申報臨床試驗(yàn)時,除須按本指導(dǎo)原則中"研究內(nèi)容和制品質(zhì)量控制"準(zhǔn)備材料外,同時需提供下述材料:
(1)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和進(jìn)展(綜述)。包括:
1.所用基因的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展;
2.所用載體的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展;
3.所用基因?qū)胂到y(tǒng)和方法的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展;
4.該研究或制品相關(guān)的體外有效性實(shí)驗(yàn)資料;
5.該研究或制品相關(guān)的動物試驗(yàn)安全性和有效性資料;
6.該研究或制品相關(guān)的臨床試驗(yàn)安全性和有效性資料;
7.該研究或制品的生產(chǎn)工藝現(xiàn)狀;
8.該研究或制品的質(zhì)量控制現(xiàn)狀;
9.本研究或制品的先進(jìn)性和創(chuàng)新點(diǎn);
10.本研究或制品產(chǎn)業(yè)化的可行性。綜述內(nèi)容須科學(xué)客觀。
(二)本研究或制品的知識產(chǎn)權(quán)情況。包括:1)本研究或制品的知識產(chǎn)權(quán)情況闡述;2)本研究或制品的知識產(chǎn)權(quán)檢索報告和檢索結(jié)果。知識產(chǎn)權(quán)情況的闡述和檢索應(yīng)包括所用基因、載體、重組體、終產(chǎn)品的其它成分、生產(chǎn)用細(xì)胞和生產(chǎn)工藝等。
二、研究內(nèi)容和制品質(zhì)量控制
(一)DNA重組體或基因?qū)胂到y(tǒng)的構(gòu)建
1.治療用的目的基因
詳細(xì)說明基因治療所用的目的基因及其來源(尤其是有否涉及國內(nèi)外專利問題,應(yīng)有專利查詢資料),獲得目的基因的材料方法和基因鑒定結(jié)果。
2.載體
包括載體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜或基因庫資料。若有特殊的元件,如啟動子、增強(qiáng)子及PolyA位點(diǎn)等,應(yīng)提供詳細(xì)資料。若有改變結(jié)構(gòu)(如丟失片段,點(diǎn)突變或插入片段),須提供DNA測序結(jié)果。若屬新的或改變結(jié)構(gòu)的病毒載體,須提供組建的材料、方法、組建步驟及鑒定結(jié)果的全部資料。
非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng),均需一個能在人體細(xì)胞表達(dá)目的基因的質(zhì)粒。除裸露DNA外,還須附加其它的組分進(jìn)行加工,如脂質(zhì)體、多肽、金屬顆粒等。本指導(dǎo)原則不包括寡聚核苷酸(如AntisenseRNA,Ribozyme,RNAi等)類基因治療制品。
3.DNA重組體
詳細(xì)說明克隆步驟,材料方法;DNA序列分析圖譜和結(jié)果,注明啟動子、增強(qiáng)子、插入順序、目的基因及polyA順序等;重組體的限制性酶切圖譜和鑒定結(jié)果;重組體中基因表達(dá)水平和時程。
4.基因?qū)胂到y(tǒng)構(gòu)建包括病毒載體與非病毒載體基因?qū)胂到y(tǒng)。
(1)病毒載體基因?qū)胂到y(tǒng)包括腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體基因?qū)胂到y(tǒng)等。需詳細(xì)描述形成單克隆原始病毒顆粒的方法、材料、技術(shù)路線和全部的鑒定方法、標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果。這些鑒定一般包括:結(jié)構(gòu)鑒定(限制性酶切圖譜和PCR分析)、整個病毒的序列分析(≤40kb),基因體外表達(dá)和生物活性,SDS-PAGE、表達(dá)盒DNA序列分析、Westernblot分析、轉(zhuǎn)染效率、透射電鏡負(fù)染法觀察、復(fù)制型病毒的檢測和其它污染因子的檢測。
(2)非病毒基因?qū)胂到y(tǒng)除裸DNA外,一般包括兩個部分:一是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體;二是其它載體物質(zhì),如脂質(zhì)體、多肽或金屬粒子等。為此,需說明目的基因?qū)胂到y(tǒng)的性質(zhì)與內(nèi)容。由于部分病人對青霉素的過敏反應(yīng),最好不用耐氨芐青霉素基因作耐藥基因,而建議用卡那霉素或新霉素基因作耐藥基因。若用物理方法導(dǎo)入,須提供其詳細(xì)方法、步驟,基因?qū)胄始捌浔磉_(dá)的生物活性以及導(dǎo)入細(xì)胞后基因的穩(wěn)定性,無重排或突變的證據(jù)。每一操作步驟必須鑒定其結(jié)果,通常的鑒定內(nèi)容和方法有:限制性酶切圖譜,基因的PCR擴(kuò)增,表達(dá)盒DNA序列分析,SDS-PAGE,Westernblot分析等。
(二)細(xì)胞庫及工程菌庫的建立和檢定
包括包裝和繁殖重組病毒的細(xì)胞庫和擴(kuò)增重組質(zhì)粒的工程菌庫。必須建立三級庫,即原始細(xì)胞庫(PrimarySeedBank)、種子細(xì)胞庫(MasterCellBank)和工作細(xì)胞庫(WorkingCellbank);或原始工程菌庫、種子工程菌庫和工作工程菌庫。
1.細(xì)胞庫
(1)原始細(xì)胞庫
需說明來源、代數(shù)、細(xì)胞特性及有關(guān)檔案資料。對主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫需詳細(xì)說明建庫過程,包括材料、方法、步驟、細(xì)胞庫存的數(shù)量和登記檔案等。
(2)主細(xì)胞庫
主細(xì)胞庫由原始細(xì)胞庫直接傳代建立或通過亞克隆方法篩選后建立。應(yīng)明確使用代次。
(3)工作細(xì)胞庫
工作細(xì)胞庫由主細(xì)胞庫傳代建立。應(yīng)明確工作細(xì)胞庫的使用代次。
(4)細(xì)胞庫檢定
①主細(xì)胞庫或工作細(xì)胞庫檢定應(yīng)依據(jù)《生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞的制備及檢定規(guī)程》的要求進(jìn)行。
②病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒的產(chǎn)量等的檢定
③導(dǎo)入基因的存在狀態(tài),穩(wěn)定性及其表達(dá)水平的檢測
④復(fù)制型病毒的檢測
若需用其它輔助病毒,須說明其來源、分離的方法步驟和傳代次數(shù)等。
2.工程菌庫
工程菌主種子庫和工作種子庫的建立和檢測應(yīng)按現(xiàn)行《中國藥典》相關(guān)要求建立。
(1)工程菌主種子庫的檢定
①菌種同一性鑒定:菌種/株的來源、基因型及表型;蛐屯
過RAPD方法鑒定,通過測定重組質(zhì)粒的特殊標(biāo)記和抗藥性標(biāo)記確定表型。
②菌種培養(yǎng)純度檢定:外源因子(如雜菌、真菌、噬菌體等)的檢測。
③菌種穩(wěn)定性檢定:轉(zhuǎn)化菌的比例,擴(kuò)增條件、質(zhì)?截悢(shù),基因表達(dá)量、允許的傳代次數(shù)。
④基因表達(dá)盒序列分析:插入的目的片段以及調(diào)控序列進(jìn)行測序分析。
(2)工程菌工作種子庫的檢定
除外基因表達(dá)盒序列分析,其它檢定內(nèi)容按上述工程菌主種子細(xì)胞庫的檢定。
(三)基因治療制品制備和生產(chǎn)工藝
1.一般要求
(1)制備和生產(chǎn)條件及環(huán)境說明。強(qiáng)調(diào)基因治療制品的制備和生產(chǎn)須按GMP要求進(jìn)行,特別是對exvivo方式的細(xì)胞制品和重組病毒制品。臨床前研究和臨床研究用的重組病毒制品應(yīng)該在經(jīng)驗(yàn)證的(validatable)生產(chǎn)工藝途徑下制備。
(2)詳細(xì)的制備和生產(chǎn)工藝方法、材料和技術(shù)路線。
(3)制備和生產(chǎn)過程控制。在生產(chǎn)過程中,一些步驟必須進(jìn)行監(jiān)測,并要求有監(jiān)測記錄。
(4)一批制品生產(chǎn)的原始制造及檢定記錄。
(5)中國藥品生物制品檢定所或由國家藥品監(jiān)督管理局指定的單位對一批制品的檢定報告。
2.以重組病毒作為基因治療制品者,要求必須建立種子病毒庫和工作病毒庫。工作病毒庫直接從種子病毒庫病毒接種細(xì)胞傳代制備。需詳細(xì)描述病毒庫的來源、建立、克隆性,傳代和保存條件和方法。其質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)見本指導(dǎo)原則有關(guān)部分。須從工作細(xì)胞庫細(xì)胞復(fù)蘇,傳代成生產(chǎn)細(xì)胞開始工藝過程,不得用非細(xì)胞庫來源的細(xì)胞直接進(jìn)行生產(chǎn)。做重組病毒制品時,須使用工作病毒庫的病毒去感染生產(chǎn)細(xì)胞,不得用非病毒庫來源的病毒直接進(jìn)行生產(chǎn)?梢允褂觅N壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。病毒庫可以不經(jīng)過純化而直接從細(xì)胞裂解液來制備。制劑配方也十分重要,不合適的制劑配方會影響制品活性和保存期限。
3.非病毒型重組質(zhì)粒DNA復(fù)(混)合物作為最終制品者,要求需詳述。
(1)重組質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)制備和質(zhì)控
(2)脂質(zhì)體的來源和性質(zhì),或者制備方法
(3)多肽的來源和性質(zhì),或者合成方法
(4)其它成分的來源和性質(zhì),或者制備方法
(5)重組質(zhì)粒DNA復(fù)(混)合物終制品的生產(chǎn)制備和質(zhì)控
通過基因槍等物理和化學(xué)方法將基因?qū)肴梭w者,需說明目的基因的制備、表達(dá)、裸DNA大量擴(kuò)增、分離、純化,儀器設(shè)備的性能和詳細(xì)的導(dǎo)入方法。
4.以基因工程化的細(xì)胞為最終制品者,包括exvivo及其它形式的基因治療。該類制品應(yīng)參照《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行。詳細(xì)說明細(xì)胞擴(kuò)增的全部制備工藝,包括生產(chǎn)流程、所用培養(yǎng)液及其配制方法、細(xì)胞收集、細(xì)胞的exvivo轉(zhuǎn)染方法及篩選。洗滌最終制品中所用的保存液配方。
(四)制品的質(zhì)量控制
根據(jù)基因治療類制品的生產(chǎn)工藝特點(diǎn),其質(zhì)量控制的原則主要是:檢定項(xiàng)目盡可能在成品中進(jìn)行;如成品中的添加成份影響檢定結(jié)果,則需在原液中進(jìn)行。
1.重組病毒作為基因治療制品的質(zhì)量控制
根據(jù)目前國內(nèi)外的進(jìn)展和完善程度,這里以重組腺病毒(rAd)制品制品來描述重組病毒基因治療制品的質(zhì)量控制,其它的重組病毒制品可參考這些質(zhì)控要點(diǎn)。
(1)重組腺病毒(rAd)作為基因治療制品的質(zhì)量控制
①原液檢定:
a.無菌試驗(yàn)
按2000年版《中國生物制品規(guī)程》附錄《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
b.病毒顆粒數(shù)測定
c.具有感染能力病毒顆粒的測定(病毒活性)
②半成品檢定
a.無菌試驗(yàn)
b.病毒顆粒數(shù)測定
c.內(nèi)毒素測定
③成品檢定
a.物理檢查
b.外觀
c.裝量
d.化學(xué)檢定:pH值
e.鑒別試驗(yàn)
限制性酶切圖譜鑒別
插入基因檢測
f.純度:可采用A260nm/A280nm值法或HPLC法
g.病毒滴度測定
病毒顆粒數(shù)測定,采用A260紫外吸收法測定。?
具有感染能力病毒顆粒的測定,采用TCID50法!糧K)〗
病毒比滴度(比活性IU),病毒感染滴度/病毒顆粒數(shù)(IU/VP)應(yīng)高于3.3%。
h.效力試驗(yàn)
插入基因表達(dá)活性測定
插入基因的生物學(xué)活性測定
i.復(fù)制型病毒(RCA)檢測
A549細(xì)胞檢測法,每3.0×1010VP中應(yīng)不高于1RCA(即≤1RCA/3.0×1010VP)
j.腺相關(guān)病毒的檢測
采用PCR法,應(yīng)無腺相關(guān)病毒(AAV)的污染。
k.殘留量測定
應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝及成品的添加成份,對有潛在危險性的成份進(jìn)行殘留量檢測。
l.無菌試驗(yàn)
m.異常毒性試驗(yàn)
n.內(nèi)毒素檢測
重組病毒制品的穩(wěn)定性試驗(yàn):需對保存條件、保存液配方及至少對三批樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察。應(yīng)進(jìn)行不同溫度及反復(fù)凍融對活性影響的研究。
(2)以exvivo形式用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(同體或異體)制品的質(zhì)量控制
該類制品應(yīng)參照《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行。應(yīng)特別注意復(fù)制型病毒的檢測。檢測的范圍,包括前述種子細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫,生產(chǎn)后細(xì)胞及最后病毒制品。細(xì)胞上清液的取樣應(yīng)相當(dāng)于培養(yǎng)上清液的5%。生產(chǎn)病毒后細(xì)胞取樣量須達(dá)每批中1%或108細(xì)胞(取少的)。檢測方法應(yīng)包括至少5代的細(xì)胞共培養(yǎng)擴(kuò)增(如用Musdunni細(xì)胞),隨后須用PG4S /L-法、標(biāo)記挽救法或RT/PCR中的兩種方法來檢測。必須用陽性對照(COS4070A上清液)及陰性對照作嚴(yán)格定量標(biāo)化,證明其敏感性及可靠性。PCR應(yīng)利用放射性同位素雜交或同樣敏感的系統(tǒng)。
若為釋放病毒的細(xì)胞,須測定:
①細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志、染色體組型及其同一性。
②活細(xì)胞比例和細(xì)胞濃度。
③目的基因存在狀態(tài)、表達(dá)及其穩(wěn)定性。尤其要說明對基因及其載體導(dǎo)入后是否出現(xiàn)基因"插入性突變"及其觀察方法及結(jié)果。
④細(xì)胞凍融后的質(zhì)控
凍融后細(xì)胞存活數(shù)、基因表達(dá)或轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的活性。
凍融后細(xì)胞上清液中的下列檢測結(jié)果:
a.無菌試驗(yàn)
b.熱原質(zhì)實(shí)驗(yàn)
c.凍融后細(xì)胞的異常毒性試驗(yàn)。
d.病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因活性。
e.支原體檢查。
若為逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液,須測定:
①病毒滴度
②病毒結(jié)構(gòu)檢定
③病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的活性
④復(fù)制型病毒(RCR)的檢測。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒或RCR具有
整合入人細(xì)胞染色體的特性,有遺傳性毒性,因此對制品中RCR的檢測要嚴(yán)格進(jìn)行和嚴(yán)格要求。
⑤上清液中的細(xì)菌、熱原質(zhì)及其它外源因子等。
⑥上清液中牛血清蛋白殘留量。
鑒于某些細(xì)胞產(chǎn)品,有效期較短,而有些項(xiàng)目的檢查須較長的時間(如支原體),這些試驗(yàn)項(xiàng)目可對每批最終產(chǎn)品作留樣檢查,而該檢測結(jié)果將為產(chǎn)品的質(zhì)控提供完整的資料。若留樣檢查發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,應(yīng)及時對生產(chǎn)過程作檢查,對已發(fā)放的產(chǎn)品立即采取措施停止使用。
2.非病毒型重組DNA基因治療制品
(1)純度:超螺旋型的含量,細(xì)菌基因組DNA、RNA和蛋白殘留量。
(2)DNA結(jié)構(gòu)檢測
(3)脂質(zhì)體、多肽或金屬粒子等的來源和性質(zhì)。由于脂質(zhì)體的形成及多肽類合成過程的隨機(jī)性,不可能達(dá)到一般化學(xué)合成物的均一性及純度,為此應(yīng)提供不同批號間保證安全有效的可以達(dá)到的最大均一性的程度。
(4)無菌試驗(yàn)
(5)熱原質(zhì)試驗(yàn)
(6)過敏試驗(yàn)
(7)異常毒性試驗(yàn)
(8)介導(dǎo)目的基因的活性檢測
(9)有害物質(zhì)殘余量的測定
(五)基因治療的有效性試驗(yàn)
有效性試驗(yàn)包括:
1.體外試驗(yàn)
須證明該外源基因?qū)爰?xì)胞后,能表達(dá)并能達(dá)到治療效果的依據(jù)。若屬exvivo,須提供該細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量及細(xì)胞導(dǎo)人體內(nèi)后預(yù)期的效果。
2.體內(nèi)試驗(yàn)
提供動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在體內(nèi)靶組織中基因?qū)氲男省⒈磉_(dá)狀態(tài)及可達(dá)到治療的目的。證明在非靶組織器官中基因表達(dá)的分布。動物種類根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷男枰。?dǎo)入的途徑應(yīng)盡可能接近于臨床試驗(yàn)的途徑或條件。由于小動物對某些途徑(如動脈插管)有一定困難,若改變導(dǎo)入途徑須說明原因及依據(jù)。
若有些方案在動物中難以觀察其療效(如種族差異),應(yīng)充分提供有效性的間接或旁證資料或依據(jù)。
(六)基因治療的安全試驗(yàn)
對質(zhì)控合格的基因治療制劑,須提供以下安全性試驗(yàn)的資料:
1.總體安全性評估
除了在質(zhì)控中已規(guī)定的各項(xiàng)要求外,對于exvivo用基因工程化的自體或異體細(xì)胞導(dǎo)人體,應(yīng)提供以下資料:
(1)生長因子的依賴性細(xì)胞,對其生長行為必須予以監(jiān)檢。若某細(xì)胞株在傳代過程中失去對該生長因子的依賴性,不能再予以使用。
(2)對同種異體細(xì)胞的移植,必須從免疫學(xué)方面提供其安全性依據(jù)。
(3)對異種細(xì)胞,必須提供該異種細(xì)胞在體內(nèi)存活的時間及其安全性的依據(jù)。
(4)致癌試驗(yàn)。無論是自體或異體細(xì)胞,經(jīng)基因操作后,均須作致瘤試驗(yàn)。對于瘤苗類制品,必須提供該瘤細(xì)胞經(jīng)過何種處理能有效地阻止繼續(xù)增殖的證據(jù)。致癌試驗(yàn)包括軟瓊脂細(xì)胞生長及裸鼠內(nèi)致癌試驗(yàn)。
(5)細(xì)胞種類均一性的監(jiān)控。對瘤苗類制品,應(yīng)提供如何去除非腫瘤細(xì)胞的方法、步驟及其可靠性的依據(jù)。若從腫瘤組織中分離非腫瘤細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞),則必須提供消除腫瘤細(xì)胞的方法、步驟及其可靠性(包括致癌試驗(yàn)在內(nèi))的依據(jù)。
(6)復(fù)制型病毒的檢測,若應(yīng)用病毒型導(dǎo)入系統(tǒng)必須嚴(yán)格檢查復(fù)制型病毒。
(7)添加物:除細(xì)胞培養(yǎng)及保存所用的試劑外,某些exvivo或invivo導(dǎo)入基因或細(xì)胞時,需要加用其它添加物,對此類物質(zhì)必須有動物實(shí)驗(yàn)證明其安全性。
2.分子遺傳學(xué)的評估
對invivo的治療方案,必須提供動物體內(nèi)重組病毒或重組DNA制品導(dǎo)入靶組織與非靶組織的分布情況、基因的表達(dá)情況。對于exvivo的方案。須提供導(dǎo)入基因的細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后的活性和目的基因的表達(dá)情況和分布。
3.毒性反應(yīng)的評估
這是安全性試驗(yàn)的重要組成部分。invivo的方案必須提供毒性反應(yīng)的詳細(xì)資料。除目的基因可能導(dǎo)致的毒性外,導(dǎo)入系統(tǒng)的安全性評價至為重要,其安全性評估應(yīng)包括急性毒性(最大耐受量)及長期毒性試驗(yàn)。毒性試驗(yàn)所用的劑量,除包括相當(dāng)于臨床使用劑量(按體重或表面積計算)外,尚需有一個較大的劑量范圍。劑量范圍應(yīng)包括大于臨床使用劑量以確定最大耐受量。給藥途徑應(yīng)盡可能模擬臨床給藥或?qū)氲男问。若改變途徑須說明其原因及依據(jù)。毒性反應(yīng)的觀察,除常規(guī)檢測項(xiàng)目外。應(yīng)包括與基因治療相關(guān)的檢測指標(biāo)。
對于exvivo方案,對瘤苗類或淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞類等自體細(xì)胞的導(dǎo)入,一般可免做動物急性和長期毒性試驗(yàn)。但若加入特殊的添加物(如明膠、縫線、特殊的導(dǎo)管等),以及對于某些重要人體臟器內(nèi)導(dǎo)入(如心、腦、肝等),必須作動物體內(nèi)毒性作用的試驗(yàn),并提供詳細(xì)資料。若exvivo方案添加細(xì)胞因子,亦必須提供其安全性的資料。對采用皮膚、皮下、肌肉給藥途徑的方案,無論是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的資料。
4.免疫學(xué)的評估
無論病毒型與非病毒型載體系統(tǒng),均需注意進(jìn)入體內(nèi)后的免疫反應(yīng)有關(guān)的問題,包括過敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)以及機(jī)體的自身免疫反應(yīng)(如對裸DNA)等,并對可能發(fā)生的免疫反應(yīng)提出相應(yīng)的監(jiān)控及處理措施。
對用于改變機(jī)體免疫狀態(tài)的目的基因及其導(dǎo)入系統(tǒng)(如瘤苗、導(dǎo)入細(xì)胞因子基因或輸入基因工程化的免疫細(xì)胞),更需提供它所引起的機(jī)體免疫改變以及可能的副作用的資料(參照《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》)。
5.致癌試驗(yàn):見本指導(dǎo)原則相關(guān)部分。
(七)基因治療臨床試驗(yàn)方案
基因治療不同于一般生物技術(shù)制品的臨床應(yīng)用,首先是它的復(fù)雜性,例如對于exvivo方式,需有經(jīng)驗(yàn)的臨床單位和專家將制品輸入或埋入人體的特定組織,甚至通過手術(shù)進(jìn)行操作;二是它的風(fēng)險性,尚存在許多未知的因素,須對臨床研究的全過程進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)控,并在申請臨床研究時須提供下列資料:
1.提供申報單位符合GMP生產(chǎn)條件的證明。
2.提供臨床研究單位和直接參與研究人員的名單和簡歷。
3.明確給藥的方式、劑量、時間及療程。如需通過特殊的手術(shù)導(dǎo)入治療制劑,須提供詳細(xì)的操作過程。
4.一般臨床指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)室檢測。
5.病人及家屬的同意書
6.靶組織和非靶組織的分子生物學(xué)檢測。
靶組織和非靶組織的分子免疫學(xué)檢測。若導(dǎo)入重組病毒或可能改變機(jī)體免疫狀態(tài)的制劑,須針對性地提供觀察人體免疫學(xué)方面的相關(guān)檢測指標(biāo)及對可能發(fā)生的免疫學(xué)反應(yīng)的必要處理措施。
7.可能產(chǎn)生的副作用或不良反應(yīng)的記錄,建立實(shí)施治療方案中的事故報告制度。
8.隨訪的計劃及實(shí)施辦法。
(八)倫理學(xué)考慮
必須充分重視倫理學(xué)的原則,并具體按國家藥品監(jiān)督管理局GCP規(guī)定的要求嚴(yán)格實(shí)施。包括在實(shí)施本方案前,須向病人說明該治療方案屬試驗(yàn)階段,它可能的有效性及可能發(fā)生的風(fēng)險,同時保證病人有權(quán)選擇該方案治療或中止該方案治療,以及保證一旦中止治療能得到其它治療的權(quán)利。嚴(yán)格保護(hù)病人的隱私。在病人及家屬充分理解并簽字后才能開始治療。