材料與方法

1．抗原動(dòng)物及免疫方法 抗原為哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的馬傳貧病毒株培養(yǎng)物制備的可溶性抗原。免疫動(dòng)物為6～8周齡的Balb/c鼠。初次免疫用含完全佐劑抗原0.2ml（病毒含量為1.0×108／ml制備的可溶性抗原）腹腔接種，經(jīng)2周再次免疫接種，應(yīng)用不完全佐劑抗原0.2ml腹腔接種，再經(jīng)3周強(qiáng)化免疫，接種可溶性抗原0.3ml，3天后取脾臟。

2．細(xì)胞培養(yǎng) SP2/0鼠骨髓瘤胞株，培養(yǎng)液為含0.025Mol/L HEPES的RPMI－1640（pH7.3），另加新生牛血清15％NEAA液1％，丙酮酸鈉（1.1％）和谷氨酰胺（2.92％）各1％，青鏈霉素（100U或µg/ml）1％，39℃CO2培養(yǎng)箱中孵育，CO2濃度為5％。

3．細(xì)胞融合及克隆化 取SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞1.0×107/ml和脾細(xì)胞2.0×107個(gè)/ml，離心沉淀?xiàng)壣锨�，然后向�?xì)胞沉淀中加入細(xì)胞融合劑0.7ml（50％PEG 4 000），按常規(guī)細(xì)胞融合程序進(jìn)行。用HAT完全培養(yǎng)基做稀釋，培養(yǎng)在事先加有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)7天具有雜交瘤細(xì)胞增殖，形成有數(shù)十個(gè)細(xì)胞菌落。當(dāng)對(duì)其培養(yǎng)上清液檢查抗體為陽(yáng)性時(shí)，以96孔培養(yǎng)板有限稀釋法和鋼杯法將細(xì)胞做克隆化培養(yǎng)和增殖，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

4．抗體檢測(cè)及鑒定
(1) ELISA法：HRP標(biāo)記兔抗鼠Balb/c結(jié)合物（北京生物制品研究所購(gòu)買），用MR580微量ELISA自動(dòng)讀數(shù)儀判讀結(jié)果。

(2) IF法：直接法用兔抗鼠Balb/c IgG熒光抗體診斷血清對(duì)雜交瘤細(xì)胞染色，對(duì)照用SP2/0細(xì)胞，間接法用感染馬傳貧病毒的驢胎皮膚細(xì)胞及其正常驢胎皮膚細(xì)胞分別載于涂片上丙酮固定后，加A4、A5及C4培養(yǎng)物上清液，置37℃30min，然后用PBS洗滌三次，再用兔抗鼠Balb/c IgG熒光抗體診斷血清，置37℃30min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察，并用SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)物上清做陰性對(duì)照。鏡下細(xì)胞呈綠色熒光者判為陽(yáng)性。

(3) 瓊脂免疫雙擴(kuò)散法

(4) SDS—PAGE法

(5) McAb的純化，以雜交瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液和腹水做SPA－Sepbarosecl－4B親和層析。

(6) 雜交瘤細(xì)胞染色體的檢測(cè)

(7) 中和試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

結(jié)果

1．雜交瘤細(xì)胞的篩選 融合后的細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，第7天融合細(xì)胞開始增殖，經(jīng)ELISA和IF篩選，獲得A4、A5及C4三個(gè)分泌馬傳貧病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。

2．馬傳貧雜交瘤細(xì)胞的染色體組型分析 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)為72，Balb/c鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40，雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)4為97.80±3.87；A5為 100.93±5.50；C4為98.10±4.47。

3．馬傳貧雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的動(dòng)力學(xué) 對(duì)A 4、A5 和C4三株雜交瘤細(xì)胞1~60代培養(yǎng)上清液進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，A4、A5兩株抗體分泌較為穩(wěn)定，C4株的抗體分泌有逐漸減少的趨勢(shì)。

4．馬傳貧雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的特異性 以A 4、A5 和C4雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液分別給Balb/c鼠腹腔接種后引起的腹水及該鼠的抗血清同馬傳貧病毒（遼系毒和黑系毒）。能感染馬匹的乙腦病毒和同為逆轉(zhuǎn)錄病毒科的牛白血病病毒抗原進(jìn)行ID、CF及ELISA檢測(cè)，僅見同馬傳貧抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)，其余皆陰性。