經(jīng)過抗體測(cè)定的陽性孔,可以擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行克隆,以得到單個(gè)細(xì)胞的后代分泌單克隆抗體。克隆的時(shí)間一般說來越早越好。因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)期各種雜交瘤細(xì)胞同時(shí)旺盛生長,互相爭奪營養(yǎng)和空間,而產(chǎn)生指定抗體的細(xì)胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時(shí)間也不宜太早,太早細(xì)胞性狀不穩(wěn)定,數(shù)量少也易丟失。
克隆化的陽性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)過一段時(shí)期培養(yǎng)之后,也還會(huì)因?yàn)榧?xì)胞突變或特定染色體的丟失,使部分細(xì)胞喪失產(chǎn)生抗體的能力,所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng)。克隆化次數(shù)的多少由分泌能力強(qiáng)弱和抗原的免疫性強(qiáng)弱而決定。一般說,免疫性強(qiáng)的抗原克隆次數(shù)可少一些,但至少要3~5次克隆才能穩(wěn)定。
克隆化的方法很多,包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。
有限稀釋法
1.材料
(1)微量培養(yǎng)盤,盤內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細(xì)胞(即飼養(yǎng)細(xì)胞)每孔2萬~4萬。
(2)HT培養(yǎng)基
2.操作方法
(1)取出抗體陽性孔細(xì)胞,用HT培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。并取樣進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色,計(jì)數(shù)。
(2)用HT培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成200個(gè)/ml、40個(gè)/ml、20個(gè)/ml和的懸液。
(3)用吸管將細(xì)胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤,每孔0.05ml,細(xì)胞含量分別為10個(gè)/孔、2個(gè)/孔、1個(gè)/孔和0.5個(gè)/孔。
(4)5%CO2飽和濕度,37℃培養(yǎng)。
(5)每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況,選擇只有一個(gè)集落生長的孔,棄掉兩個(gè)以上和沒有細(xì)胞生長的孔。
(6)克隆大量繁殖后,布滿孔底的1/3~1/2時(shí),測(cè)培養(yǎng)液抗體。
(7)抗體陽性孔細(xì)胞,移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中,并傳2~4代就可以脫離飼養(yǎng)細(xì)胞,建成克隆株。
軟瓊脂克隆化
借助撒在軟瓊脂上單個(gè)細(xì)胞定位生長,而達(dá)到克隆化,具體操作如下:
1.配2.5%的瓊脂糖30ml,水浴溶化后,移入45℃水浴中。
2.將117ml完全DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合,置45℃水浴預(yù)熱。
3.將瓊脂糖與DMEM液混合,即為含0.5%瓊脂糖的完全DMEM液,并加75×108 脾細(xì)胞。
4.每塊平皿加10ml,于室溫中凝固。
5.DMEM中的細(xì)胞與DMEM—瓊脂1:1混合,將細(xì)胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上,使其全部覆蓋。
6.放入CO2箱飽和濕度,37℃培養(yǎng)10天。
7.用PBS配制0.6%瓊脂糖,于沸水浴溶解后,置45℃,在保溫情況下取一試管,迅速加入0.1ml 25%羊紅血球,0.2ml豚鼠補(bǔ)體,2.7ml 0.6%瓊脂糖。
8.用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,可篩選抗羊紅血球Ig。
顯微鏡操作法
在直徑6cm培養(yǎng)皿中,加入1ml 1.0×108細(xì)胞懸液放置5%CO2飽和濕度,37℃溫箱中放置30min以上,倒置顯微鏡下,尋找那些與周圍相距甚遠(yuǎn)的單個(gè)細(xì)胞,將毛細(xì)管口(一頭有直角彎頭毛細(xì)管,一頭連接一尺長乳膠管,用口控制液體進(jìn)入)水平置放于液面上,左右微動(dòng),直到看見管口,對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞,吸入毛細(xì)管,將管中細(xì)胞移到預(yù)先加有2.0×104~5.0×104飼養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi),培養(yǎng)后,即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克隆。
熒光激活分離法
用一種熒光激活細(xì)胞分類器(Fluorescein Activafed Cell Sorter,F(xiàn)ACS)。其基本原理是:將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后,經(jīng)噴嘴形成單個(gè)細(xì)胞的線形液滴,在萊塞光激發(fā)下,熒光素發(fā)射熒光,此信號(hào)由光電倍增管接收,再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號(hào),經(jīng)電腦處理,產(chǎn)生信號(hào)并與預(yù)定的信號(hào)對(duì)比,根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞大小不同,將細(xì)胞分成不同級(jí)別,在電場中發(fā)生偏離,而分別收集于不同容器中。