原理
利用酶標(biāo)記抗原(抗體)和待測(cè)抗體(抗原)在電場(chǎng)中向一定方向移動(dòng),在比例適當(dāng)?shù)牡胤叫纬沙恋砭,通過酶作用底物而顯色,指示沉淀線的存在。該法的敏感性大大高于對(duì)流免疫電泳。
本試驗(yàn)以檢測(cè)血吸蟲抗體為例。
材料與試劑
1.0.02Mol/pH 8.6巴比妥緩沖液
巴比妥 0.553g
巴比妥鈉 3.503g
乳酸鈣 0.512g
H2O 加至 1 000ml
2.0.1Mol/L pH7.0PBS(0.14Mol/L Nacl)
3.0.2Mol/L pH7.6硼酸緩沖液
硼酸 10.510g
硼砂 2.860g
H2O 加至 1000ml
操作方法
1.酶標(biāo)抗原的制備 用1ml血吸蟲卵抗原(蛋白含量為1.5mg/ml~2.0mg/ml)加入3mg~4mg辣根過氧化物酶(蛋白質(zhì):酶=1︰2),液體呈棕紅色,然后在輕輕攪拌下,緩慢加入50μl 1%戊二醛,要求在5min~10min內(nèi)滴加完畢。置20℃~25℃攪拌2h。裝入透析袋,于1000ml、0.1Mol/L pH7.0PBS液4℃透析2天,并換液3次~4次。取出酶標(biāo)記物加等量純甘油,使含50%甘油試劑,即為酶標(biāo)抗原。分裝小瓶,存于-20℃中備用。
2.瓊脂凝膠板的制備 取優(yōu)質(zhì)瓊脂,以0.02Mol/L pH8.6巴比妥緩沖液制成1%瓊脂,溶化后,置于玻片上,制成2mm厚的凝膠板。
3.打孔加樣 打6對(duì)孔,抗原孔徑為0.30cm,抗體孔為長(zhǎng)方形0.2cm×1.1cm?乖、抗體各加5μl及50μl?乖蒙鲜雒笜(biāo)抗原做1︰20至1︰30稀釋。
4.電泳 抗原孔置于負(fù)極,電壓4 V/cm ~5V/cm,電泳時(shí)間45min~60min,電泳后,于蒸餾水中蕩洗1min~2min即可,用濾紙吸去水分,并用毛細(xì)吸管吸盡長(zhǎng)孔及圓孔中的水液后,即可用底物的溶液顯色。
5.配制底物溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。將飽和聯(lián)苯胺溶液,加等量pH7.6硼酸緩沖液,然后將上液9份和0.1%過氧化氫1份相混,即為所需的底物溶液。
6.免疫酶染色 將瓊脂凝膠板置于培養(yǎng)皿中,緩緩傾入底物溶液,直至浸沒凝膠板為止,置于室溫或37℃,經(jīng)1h~2h用目測(cè)可觀察反應(yīng)結(jié)果。
結(jié)果判定
1.陽性反應(yīng):在抗原抗體孔之間呈現(xiàn)明顯的棕紅色的線條。
2.陰性反應(yīng):不出現(xiàn)棕紅色線條者。