原理
等電聚焦技術(shù)是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)。
本法的分辯率極高，所以在進行等電聚焦電泳時，要求樣品不能過于復(fù)雜，一般應(yīng)經(jīng)其他方法（如層析法）提純后再進行等點聚焦，才能得到比較滿意的結(jié)果。如利用人的純IgG再經(jīng)過等電聚焦電泳，可以滿意地分離IgG的四個亞類。如IgG2濃縮于pH7.0的部位，IgG3濃縮于pH8.0~9.0的范圍內(nèi)，IgG4則濃縮于pH6.0以下的部位，而IgG則分布于全部pH范圍，且只有IgG1能存在于pH9.0以上的部位。
等電聚焦電泳與其他分離方法結(jié)合起來，將是一項很有前途的分析鑒定和制備樣品的好技術(shù)。
器材與試劑配制
1．聚焦柱 有成品出售，分110ml和440ml兩種。
2．電源 0V~1 200V可調(diào)20W的直流穩(wěn)壓電源。
3．載體兩極電解質(zhì) 市售25ml瓶裝，濃度為40％或20％（W/V），pH范圍為2.5~11，也有其它pH范圍的，可根據(jù)實驗條件選擇購買。
4．蔗糖（分析純）
1． 電極液的配制見表：
表 電極緩沖液的配制
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正極在中心管內(nèi) |
正極在柱頂 |
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磷酸 或硫酸 |
0.05（0.2）ml或1（4）ml 1Mol/L 酸溶液 |
0.025（0.1）ml或0.5（2）ml 1Mol/L 酸溶液 |
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H2O |
15（56）ml |
5（25）ml |
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蔗糖 |
11（44）g |
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表 負極緩沖液的配制
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負極在中心管 |
負極在柱頂 |
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氫氧 化鈉 |
0.1（0.4）g或1（4）ml |
0.05（0.2）g或0.5（2）ml |
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2Mol/L 溶液 |
2Mol/L 溶液 |
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蒸餾水 |
14（56）ml |
5（25）ml |
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蔗糖 |
11（44）g |
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此配制用量為最大用量，一般用1/5的量即可。括號內(nèi)為440ml聚焦柱型號所用量配方。
6．重、輕液的配制與混合
⑴重、輕液的配制：配制方法見表：
表 重、輕液的配制方法
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110ml柱 |
440ml柱 |
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載體40％（ml） 水及蛋白質(zhì)溶液（ml） 蔗糖（g） |
重液 1.9 37 26 |
輕液 0.6 51.5 |
重液 7.6 148 104 |
輕液 2.4 206 |
此表為梯度混合器所用量，如用手工混合法則應(yīng)相應(yīng)適當增加20％。
⑵重、輕液的混合：有條件的可采用梯度混合器裝柱。手工混合法操作如下：取24支試管（440ml聚焦柱則應(yīng)取46支試管）按2-5表各加入重、輕液，充分混勻。
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試管號 |
重液（ml） |
輕液（ml） |
試管號 |
重液（ml） |
輕液（ml） |
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 |
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 |
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 |
2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 |
2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 |
表 重、輕液的混合方法
操作方法
1．決定電極的極性 如pH梯度范圍在6以下時，則聚焦柱底的電極為正極。如pH梯度的范圍在6以上時，則柱底為負極。原因是蔗糖濃度越大，電導(dǎo)越小，所以在等電點pH6～7的載體處，應(yīng)該避免蔗糖濃度最大的部位。
2．裝柱 按電極的極性與電極液的要求裝柱。將聚焦柱垂直放置，先注入底部電極液，打開中心管下端的活塞，從中心管上端，用帶長膠管的注射器注入電極液，使液面在中心管下部開口處之上達
3．注入載體溶液 加完后應(yīng)使電極液仍浸沒中心管的下部開口，不使電極與載體溶液直接接觸。
4．加重、輕混合液 從1號試管加起，用注射器沿管壁緩緩加入，流速約3ml/min，全部重、輕混合液加完后，再在上部加電極液，使上部電極浸沒。
5．連接冷凝水管。
6．電泳 電壓300V。開始電泳時，由于載體分子都不處于等電狀態(tài)，所以它們都帶電，在電場影響下向各自的等電點移動，因此開始時電流較大，以后逐漸減小。所以在開始時電壓可稍低一些。電泳結(jié)束時電流約為0.30mA，電泳時間2～3天。
7．樣品的收集 斷電后，關(guān)閉中心管下端活塞以免電極液流出，放入樣品，流速2ml/min為宜。以部分收集器收集，每管2ml。
8．測每管的pH值和蛋白含量，將相近pH的同一蛋白質(zhì)的管合并。
9．將分離的每一樣品成分過SepHadexG25（或G50），將蛋白質(zhì)與載體分離開來。