一、定義；
免疫PCR是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。
用抗體檢測抗原是免疫學的最基本方法，用酶或同位素標記抗體可使檢測的敏感性提高，常用的定量檢測方法ELISA和RIA均基于標記分子可以使檢測的信號增強。免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來的新方法，用PCR擴增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強的放大能力，其可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴增，由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
二、基本原理：
免疫PCR主要由兩個部分組成，第一部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的測定過程;第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量最終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。第一步中，首先用待測抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素(Protein A-Streptavidin)嵌合體(重組融合蛋白)中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19(質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，第一步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。
PCR由 ①待測抗原；②生物素化抗體；③親和素（連接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR擴增五部分構(gòu)成。
1 待檢抗原
被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進行檢測，需要對免疫PCR進行改進，以便能夠檢測吸附性差的抗原。免疫PCR的后續(xù)過程需PCR擴增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進行擴增，這樣可以簡化實驗過程和提高檢測的精確性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測微量抗原。
2 特異抗體
免疫PCR中的特異抗體是對應(yīng)于待檢抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和素再結(jié)合DNA。
3 連接分子
連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。目前介紹的方法中均是通過生物素與親和素系統(tǒng)使特異抗體與DNA連接，生物素和親和素作為免疫PCR的連接分子在連接方式上有許多差異。Sano首次報道PCR時用的是重組葡萄球菌A蛋白-親和素嵌合蛋白(SPA-親和素)。其具有結(jié)合IgG和生物素的兩個位點，因此可以將IgG與生物素化的DNA連接成復(fù)合物。由于重組的SPA-親和素沒有商品試劑，且SPA不但可以結(jié)合特異抗體的IgG，而且還可以與樣品中吸附于固相的無關(guān)IgG結(jié)合，特別是檢測的抗原就是某種IgG，因此，Ruzicke認為Sano的免疫PCR本底高和特異性差。Ruzicke用商品化的親和素系統(tǒng)試劑建立了一種免疫PCR，這種方法是先將親和素與生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后再與結(jié)合固相的特異性抗體結(jié)合，這種方法存在的問題是親和素與生物素化的DNA分子預(yù)結(jié)合時二者的分子比例并不是等同的，一個親和素分子可以結(jié)合4個分子生物素，因此在預(yù)結(jié)合時生物素化的DNA分子不能過多，否則DNA分子上的生物素將親和素完全飽和，親和素再無結(jié)合生物素化抗體的能力;但在低飽和生物素化DNA時，親和素結(jié)合的生物素化DNA存在許多種類的復(fù)合物，甚至還有游離的親和素，只有部分結(jié)合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用，因此，這樣預(yù)結(jié)合的親和素和生物素化DNA是一均質(zhì)性很差的混合物。雖然預(yù)結(jié)合的復(fù)合物可以減少測試過程中的1次孵育和沖洗，但是這樣的復(fù)合物作為連接分子必然導(dǎo)致敏感性低和誤差大，并且每次制備的連接分子均有差異，從而導(dǎo)致重復(fù)性差。
Hong zhou等建立了一種免疫PCR方法，連接分子是鏈親和素，在連接抗體和DNA時是以游離的方式加入，這樣鏈親和素先與生物素化抗體結(jié)合，沖洗后，再加入生物素化的DNA。這個方法雖然多了1次孵育和沖洗過程，但具有較好的敏感性和重復(fù)性。
4 DNA和PCR系統(tǒng)
免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是應(yīng)用了PCR強大的擴增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標記的dATP或dUTP通過DNA聚合酶標記在DNA分子上，一般是一個分子DNA標記兩個生物素，標記率可達百分之百。生物素化的DNA用量需預(yù)先選定，過多易出現(xiàn)非特異結(jié)合而引起本底過高，過低將導(dǎo)致敏感性低和出現(xiàn)不同濃度抗原得出同樣結(jié)果的飽和現(xiàn)象。
免疫PCR的PCR擴增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相進行抗原抗體反應(yīng)，同時又需要對固相結(jié)合的DNA進行擴增，因此，免疫PCR固相的選擇應(yīng)根據(jù)具體情況確定。用微量板作為固相必須有配套的PCR儀，以使可以用微量板直接擴增，否則需要用PCR反應(yīng)管作為固相擴增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小選擇兩種凝膠的濃度。電泳后凝膠經(jīng)染色和拍照記錄結(jié)果，再檢測底片上PCR產(chǎn)物的光密度，并與標準品比較就可以得出待檢抗原量。
三、主要程序
（一）抗原 生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；
（二）加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；
（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；
（四）PCR擴增生物素化DNA部分。
四、制作方法
（一）制備生物素化DNA
將噬粒 BLuescript skt，用生物素標記的M13引物進行PCR擴增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNA片段，即為生物素化DNA。
（二）免疫PCR模式
1 試劑
包被緩沖液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5)，含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗滌液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀釋液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1)包被
用包被緩沖液稀釋抗原(BSA)，加入微滴板中(45μl孔)，4℃過夜(約15h)，用洗滌液洗板3次×5min。
2)封閉:
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min，洗板數(shù)次。
3)抗原抗體反應(yīng):
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫(～22℃)下45min，洗板孔15次×10min，去除未結(jié)合的抗體分子。
4)鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng):
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫(～22℃)50min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10min，再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。
5)PCR
實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明膠(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每種0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。
PCR周期 PCR前，用紫外線(UV)(254nm)照射上述反應(yīng)混合物，然后將之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進行PCR周期:起始變性94℃5min;30個周期:變性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR產(chǎn)物為特定的261bp的片段。
參考流程
1. 用0.85% NaCl將細菌溶液稀釋至一定濃度。
2. 加50μl于微孔板內(nèi)，4℃過夜。同時設(shè)陰性對照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔內(nèi)）。
3. 用400μl的0.05% 溫20pBS（以下簡稱TPBS），洗滌五次。
4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封閉2小時.
5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
6. 加入100μl用0.75% NGS適當稀釋的單克隆抗體(內(nèi)含100μg的鮮魚精DNA),室溫孵育30min.
7. 用TPBS洗滌五次.
8. 加入50μl適量稀釋的生物素化抗鼠IgG抗體,室溫孵育30min.
9. 用TPBS洗滌五次.
10.加入60μl適量稀釋的生物素化DNA和親和素,室溫孵育30min.
11.用TPBS洗滌五次,再用HPLC級水洗三次.
12.PCR擴增:加入50μl PCR反應(yīng)液(內(nèi)含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec,循環(huán)30次.取PCR產(chǎn)物10μl于1.7%瓊脂糖凝膠上電泳,和核酸分子量標準相比較,在相應(yīng)的位置郵現(xiàn)電泳帶為陽性.必需時將電泳結(jié)果照像,進行定量分析.
3 PCR產(chǎn)物的檢測與定量技術(shù)
1）凝膠檢測系統(tǒng) 用凝膠掃描儀或計算機輔助視頻設(shè)備對溴化乙錠染色的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行定量，放射性標記的擴增產(chǎn)物可通過放射自顯影定量測定，最近用自動DNA測序儀檢測熒光標記的核酸，這種方法可準確測量擴增產(chǎn)物的大小，而且其檢測靈敏度達fg水平，但由于自動DNA序列儀和熒光標記引物極為昂貴，所以現(xiàn)在僅用于研究。
2）HPLC檢測系統(tǒng) 此法的優(yōu)點為PCR產(chǎn)物不用純化，對未標記的產(chǎn)物靈敏度可達fg水平，對標記產(chǎn)物的檢測限度可能更低。HPLC能區(qū)分不同分子的大小，可允許我們使用不同大小的內(nèi)標衡量擴增的效率。
3） 固相測定系統(tǒng) 最常用的為96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用儀器比色或讀數(shù)，可用親合素分子通過疏水相互作用包被滴定板，此固相系統(tǒng)可特異結(jié)合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR產(chǎn)物的定量，如用生物素和地高辛雙重標記的擴增產(chǎn)物可用微量滴定板法定量，將生物素和地高辛同時標記PCR產(chǎn)物的方法有三種途徑:①在反應(yīng)混合物中同時加入地高辛和生物素標記的脫氧核苷酸類似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛標記的引物2。定量方方法為:雙重標記的擴增產(chǎn)物用乙醇沉淀以去除未結(jié)合的標記物，然后加至親合素包被的微量滴定板上溫育至少2小時，洗滌數(shù)次后，與DIG抗體:AP結(jié)合物溫育，根據(jù)其底物不同可產(chǎn)生不同的顏色，親合素介導(dǎo)的固相捕獲生物素標記靶分子的技術(shù)是一個有效、靈活和容易操作的技術(shù)，將成為定量PCR的一個關(guān)鍵技術(shù)。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay)系統(tǒng) 用親合素包被的氟微球作為固相載體，用生物素標記引物，在擴增時摻入氟化的核苷酸，擴增完成后，加入已包被的氟微球以捕獲生物素化的PCR產(chǎn)物，此捕獲過程可使與氟微球緊密結(jié)合，氟被氘激發(fā)產(chǎn)生光脈沖，可用閃爍計數(shù)儀測量。與比色法相比，此法具有更大的線性范圍。
5）點雜交檢測系統(tǒng) 將擴增產(chǎn)物變性后固定于尼龍膜表面，與標記的DNA探針雜交，亦可將序列特異的寡核苷酸探針通過多聚T(poly T)尾巴固定于膜上，與變性后的已標記的擴增產(chǎn)物雜交，在后者由于靶基因不是直接結(jié)合于膜表面，故其反應(yīng)動力學接近于液相，反應(yīng)速度快，通常使用生物素化的探針或擴增產(chǎn)物，用親合素-AP結(jié)合物產(chǎn)生顏色斑點，通過與已知濃度的標準比較顏色強度進行定量。
6） 電化學發(fā)光檢測系統(tǒng) 通過親合素-生物素系統(tǒng)將擴增產(chǎn)物結(jié)合于磁性珠，然后與2，2'-聯(lián)吡啶-釕螯合物(TBR)標記的探針雜交，加入三丙胺(tripropylamine，TPA)溶液，并轉(zhuǎn)移至電化學發(fā)光儀的檢測池，當電極的電壓增加至一定水平時TPA和TBR都瞬時氧化，TPA氧化后生成一種不穩(wěn)定的、具有高度還原性的中間物質(zhì)，可與氧化的TBR反應(yīng)，使之進入激發(fā)態(tài)，當由激發(fā)態(tài)變?yōu)榛鶓B(tài)時可發(fā)射出620nm的光，發(fā)光強度與TBR標記物的量成正比，通過發(fā)光強度對PCR產(chǎn)物定量，此法的敏感性為amol水平，可自動化測量。
7） DNA酶免疫測定系統(tǒng) 通過抗DNA單克隆抗體與擴增產(chǎn)物結(jié)合、再通過酶第二抗體結(jié)合物進行定量測定。此法不需對引物和擴增產(chǎn)物進行標記，但易出現(xiàn)交叉反應(yīng)和單克隆抗體昂貴的費用限制了此法的廣泛應(yīng)用。
8） 激光誘導(dǎo)熒光檢測法 首先用熒光標記物FAM(商品名)的N-羥基琥珀酰亞胺酯衍生物借助氨已基連接臂偶聯(lián)于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR擴增，用毛細管電泳擴增產(chǎn)物，最后用氬離子激光光原檢測器檢測熒光強度進行定量測定。此法的優(yōu)點為樣本用量少，可自動化檢測，快速、靈敏和高分辨率。
總之，可用上述方法對靶基因定量，其準確性可通過復(fù)管測定和利用內(nèi)標使數(shù)據(jù)標準化而得到提高。由于親合素介導(dǎo)的固相捕獲生物素標記靶分子的技術(shù)具有有效、靈活和容易操作等特點，有較好的臨床應(yīng)用前景。定量PCR仍然存在技術(shù)上的問題，目前多用于研究，但在腫瘤、細菌、真菌和病毒性疾病的診斷和治療方面對此技術(shù)的需求將日益增加。
五、免疫PCR的應(yīng)用和發(fā)展
免疫PCR技術(shù)目前尚處于研究階段，還沒有一個十分成熟和滿意的方法，配套試劑尚缺乏，所以應(yīng)用的還不多，在報道的幾種方法中均是用一些已知的標準品進行試驗。Sano，Ruzicka和Hong zhou分別用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重組人原癌基因產(chǎn)物ETS;蛋白作為待檢抗原進行免疫PCR，他們的結(jié)果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產(chǎn)生的背景信號很弱，可以檢測到幾百個分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測到一個分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測一些含量特別少的抗原分子。目前介紹的免疫PCR還存在一些缺點，在報道的文獻中均采用待檢抗原直接吸附固相，這樣固相的均質(zhì)性必然對結(jié)果有很大的影響;同時檢測的樣品液中其它成分也可以吸咐固相，極易產(chǎn)生背景過高或精確度下降。另外，有些難于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR檢測，連接分子的特異性和均質(zhì)性對PCR影響很大，從理論上看Hong zhou的生物素標記抗體和DNA以及用游離的鏈親和素連接抗體和DNA是一比較理想的方法，但是如能做到生物素化抗體、親和素和生物素化DNA3個分子預(yù)先連接一個復(fù)合物，那么將簡化實驗過程。PCR擴增過程相對簡單，如用微量板作為固相需選用配套的PCR儀，否則需將其移入反應(yīng)管內(nèi)，這必然導(dǎo)致很大的誤差，經(jīng)放大可產(chǎn)生顯著差異。固相也可以直接采用某些PCR反應(yīng)管，并且可以直接用一般的PCR儀進行擴增，但沖洗過程相對復(fù)雜一些。免疫PCR具有非廣泛的應(yīng)用前景，十分有必要進一步完善免疫PCR的實驗過程和配套試劑的研制。
六、參考文獻
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