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      免疫組化非特異性背景染色及其控制方法

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

      一、非特異性染色的識(shí)別
      常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處,壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性,均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)、團(tuán)或塊狀。
      二、非特異性染色的原因
      1. Ig與Fc受體結(jié)合
      多見于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,組織細(xì)胞表面多),主要是和二抗反應(yīng),因?yàn)橐豢挂话阆♂尪染^大,因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,所以石蠟切片不多見。
      避免方法:
      ① 用以二抗相同種族的正常血清封閉切片;
      ② 用不含F(xiàn)c段的抗體,但價(jià)格貴
      (V區(qū),C1區(qū)不含F(xiàn)c段,用Pepsin消化)

      2.靜電吸附
      抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白,容易和帶正電荷的組織相結(jié)合,如膠原纖維。

      避免方法:
      ① 盡量稀釋一抗
      ② 降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
      ③ 用去垢劑 如triton-100處理切片。 Tween-20等;

      3.二抗與組織中的Ig結(jié)合
      如羊抗兔的二抗,二抗可以標(biāo)本中(人)Ig發(fā)生交叉反應(yīng),科學(xué)上越接近的動(dòng)物,交叉反應(yīng)越
      明顯,如人與猴,兔與豚鼠。
      避免方法:用與待測(cè)組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。

      4.組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合
      如醛類固定后未能徹底的沖洗,殘流醛基可以和Ig結(jié)合。
      避免方法:
      ①?gòu)氐讻_洗;
      ② 0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗;

      5.內(nèi)源性過(guò)氧化物酶
      紅細(xì)胞,粒細(xì)胞的含量尤其高,鏡下可以識(shí)別,不要將其當(dāng)成陽(yáng)性結(jié)果。
      避免方法:
      ① 石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片;
      ② 冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘(99:1)因?yàn)槲唇?jīng)固定包埋,大部分酶未被破壞;
      ③ 對(duì)于骨髓涂片
      最好用非過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體
      如堿性磷酸酶(AP)

      磷酸萘酯 水→α-萘酚 偶氮染料

      快蘭(fast blue)或快紅(fast red)
      ↓ ↓
      蘭色 紅色
      用明膠甘油封片,不能用含二甲苯的封片劑,溶于二甲苯。

      6. 內(nèi)源性生物素
      以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘;
      7. 交叉反應(yīng)
      PcAb敏感性高,但特異性稍低,容易出現(xiàn)非特異性染色。
      避免方法:
      ①盡可能稀釋抗體;
      ②盡可能用McAb;

      三、 抗體最大稀釋度的求法
      最大稀釋度的目的:
      1.節(jié)約、
      2.特異性染色↑、非特異性染色↓(決定其最大稀釋度)
      棋盤法
      如 稀釋度
      1:50 1;100 1:150 1;200
      特異性染色
      非特異性染色 - -

       

       

       
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