1 原理
中性粒細(xì)胞中的堿性磷酸酶(簡(jiǎn)稱堿酶)在一定條件下能使β-甘油磷酸鈉水解釋出無機(jī)磷, 后者與鉬酸試劑結(jié)合成磷鉬酸復(fù)合物, 再以氨基萘酚磺酸還原為鉬藍(lán)而呈現(xiàn)藍(lán)色,用光電比色法求得所釋放的無機(jī)磷含量,表示酶的活性。
2 試劑
。幔暇厶牵悍肿恿浚玻叭f,用生理鹽水配制成2%溶液,在冰箱中可保存一個(gè)月。
。猓β-甘油磷酸鈉溶液(0.026M):稱取β-甘油磷酸鈉溶于碳酸—重碳酸鹽緩沖溶液,將pH調(diào)至9.9,液面蓋一層石油醚,在冰箱內(nèi)保存。
。悖妓幔靥妓猁}緩沖液:
。烈骸》Q取無水碳酸鈉2.12g,溶于重蒸餾水100ml,配成0.2M無水碳酸鈉溶液。
。乱骸》Q取碳酸氫鈉1.68g,溶于重蒸餾水100ml,配成0.2M碳酸氫鈉溶液。
。烈海保埃埃恚炫cB液100ml混合,加重蒸餾水600ml,pH為9.9。
。洌硭兀河蒙睇}水配成2%溶液。
。澹然V溶液(0.05M):用重蒸餾水配成。
。妫纫宜崛芤海河弥卣麴s水配成50%及5%二種濃度。
。纾f酸銨溶液:稱取鉬酸銨12.50g,溶于重蒸餾水100ml,加10M硫酸150ml,再加重蒸餾水到500ml。
。瑁埃玻担グ被练踊撬崛芤海悍Q取氨基萘酚磺酸0.0625g、亞硫酸氫鈉1.33g、亞硫酸鈉0.25g,于研缽中磨成細(xì)粉,加重蒸餾水到25ml,過濾后保存于冰箱內(nèi)。用時(shí)稀釋一倍。
i.標(biāo)準(zhǔn)磷儲(chǔ)備液(每毫升含無機(jī)磷1mg): 稱取干燥恒重的分析純磷酸二氫鉀2.1971g置于容量瓶中,加重蒸餾水至500ml,加氯仿2滴,在冰箱內(nèi)保存。
j.肝素:用生理鹽水配成1%溶液。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1 白細(xì)胞分離
自耳垂或手指取血0.15ml,置于預(yù)先準(zhǔn)備好的含1滴肝素和0.30ml葡聚糖溶液的微量試管中,用手振搖混勻,靜置10分鐘。待紅細(xì)胞沉降界面清晰時(shí),小心吸出上層懸浮液,置于小離心管中,加入2倍生理鹽水,搖勻后離心(2500轉(zhuǎn)/分鐘)8分鐘。取出上清液棄去,保留沉淀。再向有沉淀的離心管加生理鹽水2ml,混勻,再離心8分鐘。重復(fù)2次,棄去上清液,管中留下液體約0.15ml,與沉淀混勻,即為白細(xì)胞懸浮液, 作白細(xì)胞計(jì)數(shù)2~4次,取其
平均值。 此白細(xì)胞懸浮液供酶活性測(cè)定之用。如不能立即測(cè)定,需放置冰箱內(nèi),
但必須在當(dāng)天測(cè)定。
3.2 白細(xì)胞堿酶活性的測(cè)定
取一小試管, 加入β—甘油磷酸鈉 0.85ml , 皂素 0.05ml,
氯化鎂0.02ml,于37℃水浴中預(yù)熱5分鐘,然后準(zhǔn)確加入白細(xì)胞懸浮液0.05ml,混勻, 繼續(xù)保溫60分鐘,到時(shí)立即加入50%三氯乙酸0.15
ml使反應(yīng)終止, 以2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,除去沉淀。
每個(gè)樣品都需作對(duì)照管測(cè)定,對(duì)照管所加內(nèi)容物同上,僅白細(xì)胞懸浮液須在保溫后加50%三氯乙酸后加入。
分別取樣品和對(duì)照管上清液0.80ml,各加入鉬酸銨試劑0.15ml,氨基萘酚磺酸溶液0.10ml,重蒸餾水1.45ml,顯色20分鐘,用分光光度計(jì)測(cè)定光密度( 所用波長(zhǎng)為660nm、比色杯厚10mm ),分別讀取樣品管、對(duì)照管的光密度。每管重復(fù)讀數(shù)兩次,取其平均值。
。常场×讟(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
取標(biāo)準(zhǔn)磷儲(chǔ)備液, 用5%三氯乙酸稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液, 濃度分別為:1.0,3.0,5.0,7.5,10.0mg/1。然后取試管5支,分別在每一試管加入1.0ml上述標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液之一種, 以及鉬酸銨0.15
ml, 氨基萘酚磺酸0.10ml,重蒸餾水1.25ml,按上法顯色,讀取
各管的光密度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
3.4 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
在取血分離白細(xì)胞的同時(shí),取1滴血作涂片,瑞氏染色,按常規(guī)分類計(jì)數(shù)嗜中性白細(xì)胞的百分比。
3.5 計(jì)算方法
白細(xì)胞堿酶活性用單位表示,以每十億個(gè)中性白細(xì)胞在37℃條件下,1小時(shí)釋放出1mg無機(jī)磷為一個(gè)單位。計(jì)算公式如下:
酶活性(單位)={〔pi(樣)—pi(對(duì))〕×10000×1.40}÷(W·V·N)
式中:pi(樣)——樣品管無機(jī)磷,μg;
。穑椋▽(duì))——對(duì)照管無機(jī)磷,μg;
。——白細(xì)胞懸液的白細(xì)胞數(shù),個(gè)/立方毫米;
。——酶反應(yīng)所加入白細(xì)胞懸液的量,ml;
。——嗜中性白細(xì)胞,%。
注:為減少操作誤差,提高結(jié)果準(zhǔn)確性,也可自靜脈采血1.5ml,按常量法進(jìn)行操作。詳見《衛(wèi)生研究》5(6):481,1976。
4 注意事項(xiàng)
a.白細(xì)胞懸液必須充分搖勻,不應(yīng)有聚集的細(xì)胞。白細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)確,一般應(yīng)計(jì)數(shù)2~4次,取平均值。
b.堿酶活性測(cè)定中,白細(xì)胞懸液的加入量要準(zhǔn)確,吸取時(shí)注意搖勻。
c.堿酶反應(yīng)保溫時(shí)間(60分鐘)要準(zhǔn)確。
。洌@色反應(yīng)不應(yīng)出現(xiàn)沉淀。
e.用分光光度計(jì)讀數(shù)時(shí),樣品管與對(duì)照管都應(yīng)重復(fù)兩次。