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      生物學研究中實驗動物的選擇

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

      一、免疫學研究中實驗動物的選擇
      在免疫學研究中,常選用以下的幾種實驗動物:
      (一)大鼠:大鼠對綿羊紅細胞和牛r球蛋白的免疫反應有品系差異。大鼠有抗體IgE,蠕蟲感染常能誘發(fā)大量的IgE抗體,它們存在于血液循環(huán)中,常規(guī)的免疫法只能使大鼠產生少量的抗體,在體內存在的時間較短。百日咳桿菌免疫大鼠主要產生IgE,如在此抗原中加入福氏完全佐劑,免疫大鼠則產生IgGa。
      (二)小鼠:小鼠的免疫球蛋白有IgM、IgA、IgE、IgG1、IgG2a和IgG2b。 小鼠很少見到典型的遲發(fā)型變態(tài)反應,也不象其它動物那樣有規(guī)律。能誘發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應,其全身性過敏反應的特點是循環(huán)不暢,循環(huán)性虛脫,常在幾小時甚至10到 20 分鐘死亡。BALB/c小鼠常用于制備單克隆抗體。
      (三)豚鼠:豚鼠中已確定的免疫球蛋白有:IgG(IgG1、IgG2)、IgA和IgE。IgG1 是變態(tài)反應的媒介,IgG2在抗原抗體的反應中起結合補體的作用。
      豚鼠除作為補體的來源外,還被用于結核菌素的皮內試驗和接觸過敏物質的遲發(fā)型變態(tài)反應的研究。豚鼠和人的結核菌素反應差別是有無細胞浸潤,另外豚鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應在24-48h達到高峰,人在48-96h達到高峰。
      (四)兔:新西蘭白兔常用于實驗室制備抗體,及被用來作過敏反應的研究。由 IgG和IgE引出的過敏反應臨床癥狀相似,機理都是抗原抗體結合和血小板-白細胞凝集形成沉淀物,釋放藥理活性物質(組織胺和5-羥色胺)進入肺循環(huán),在右心的流出道中產生一種機械和藥理的聯合作用,導致循環(huán)性虛脫。
      (五)狗:狗的免疫球蛋白有IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2。 在狗花粉病和各種蠕蟲感染中發(fā)現IgE。
      Lewis等認為狗對顆粒性抗原能較好地產生抗體,但新生狗初次免疫反應所產生的抗體幾乎是IgM類,成年狗產生的抗體幾乎是IgM和IgG,這兩種球蛋白的數量與初生狗的IgM幾乎相等。新生狗在再次反應中能合成IgG和IgM。
      除人之外,狗是對氣溶膠出現變態(tài)反應的唯一的實驗動物模型,狗是研究人的變態(tài)反應和氣喘的適宜的實驗模型。狗由豚草花粉(Raweed pillens)致敏后,血液和皮膚中出現IgE抗體。
      二、腫瘤學研究中實驗動物的選擇
      腫瘤的實驗模型一般選用小鼠和大鼠。
      (一)昆明小鼠 肉瘤180(S180)、肉瘤37(S37)、艾氏癌腹水型(EAC)、艾氏癌實體型(EC)、肝癌實體型(Heps)、Harding-Passey黑色素瘤等,可接種昆明小鼠制備實驗腫瘤模型。
      (二)615小鼠 用于小鼠網織細胞白血病L615的實驗模型。
      (三)DBA/2小鼠 用于小鼠淋巴細胞白血病L1210的實驗模型。
      (四)C57BL/6小鼠 用于Lewis肺癌,黑色素瘤B16,小鼠乳腺癌M5076的實驗模型。
      (五)Wistar大鼠 用于瓦克癌肉瘤W256,軟骨肉瘤,吉田肉瘤腹水型的實驗模型。
      三、藥理學研究中實驗動物的選擇
      藥理學研究中一般選用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等。
      (一)急性毒性試驗 常用小鼠,體重18~22g,雌雄均可。每次5~10只,尾靜脈注射或腹腔注射一定劑量藥液,觀察有無不良反應(如驚厥、四肢癱瘓、步伐不穩(wěn)、豎毛、呼吸抑制等)或死亡現象。一般觀察24~48小時。
      成人體重以50kg計算,小鼠以20g計算,即人的體重大于小鼠體重2,500倍。如人用劑量為2ml,小鼠給0.5ml不引起死亡,即小鼠最大耐受量相當于人用劑量的625倍以上。倍數越大,毒性越小。一般認為,按體重計算小鼠最大耐受量相當人用劑量的100 倍以上則較安全,可以提供臨床使用。
      (二)亞急性和慢性毒性試驗
      可選小鼠,方法和急性毒性試驗基本相似,但劑量小,小鼠按體重計算每天用人用劑量的20~50倍口服或腹腔注射,連續(xù)觀察1~8周。慢性毒性試驗則需3~6個月。觀察體重、進食量、進水量的變化,以及有無其它不良反應或死亡( 包括內臟肉眼觀察或組織切片檢查)。必要時作血象、肝腎功能化驗檢查。該項實驗也常用大鼠。
      (三)半數致死量的測定 半數致死量簡稱LD50,是指引起實驗動物半數死亡的劑量。由于個體差異,同一劑量藥物給同種異體的動物,可以出現死亡或不死亡,LD50表示藥物的毒性時比較靈敏準確。一般以每Kg多少mg表示(藥物劑量/體重)。臨床應用時一般取1/5~1/10 LD50開始試用,觀察毒性和療效。由小劑量,到大劑量逐步試用至不能耐受為止。從中找出療效滿意、毒性小的劑量,再作深入觀察。
      測定LD50時常選用小鼠,體重18~22g,雌雄均可,每次實驗需30-60只,一般分5~6組,每組6~10只。給藥途徑與臨床應用相同,有口服、腹腔注射、靜脈注射。給藥容量以每鼠0.5ml左右為宜。根據藥物出現作用的快慢,一般觀察1~4或24~72小時。 以死亡為主要指標。
      (四)過敏試驗
      取豚鼠6只,體重250~350g,每隔日腹腔注射藥液0.5ml,共注射 3次。然后分成2組,分別在第一次注射藥物的第14天及21天再從頸靜脈注射原藥液1ml。如有過敏反應,則在注射藥物后幾分鐘內,豚鼠表現興奮不安,呼吸困難,迅速窒息死亡。
      (五)熱原檢查
      熱原是由細菌產生的一種毒素。注射劑中若含有熱原,會使人發(fā)燒。
      檢查熱原使用的動物是家兔,一般選用3只,體重1.5kg以上,注射藥物前測量肛門體溫3次,取平均值(家兔的正常體溫38.5~39.6℃)。然后耳靜脈注射藥液(1~2ml/Kg),注射藥物后1小時、2小時、3小時各測體溫1次。如3兔體溫升高均不超過0.6℃,即合格,說明無熱原。
      四、其它醫(yī)學研究中實驗動物的選擇
      (一)計劃生育中實驗動物的選擇
      篩選口服避孕藥的實驗動物多使用嚙齒類實驗動物,大鼠、小鼠等,因為它們具有規(guī)律的動情周期,排卵有明顯的指標,易于檢測,價格便宜。而具有月經周期的靈長類動物反而不常被選擇。因為這類動物來源困難,價格昂貴,排卵和月經周期難于檢測。長期以來,對男用避孕藥的研究不很重視,進展緩慢。藥物能抑制精子的生成過程;干擾男性生殖活動的激素調節(jié);干擾副性腺和改變精液的理化特性,均可達到不孕的目的。常選用成年雄性大白鼠,如觀察藥物對大鼠生殖率的影響,精子數的影響,精子活動力的影響以及對雄性激素的影響。
      (二)病毒學研究中實驗動物的選擇
      病毒學研究中常選用的實驗動物有金黃地鼠、小白鼠、豚鼠、家兔、綿羊、禽類、猴等。分離病毒廣泛使用的是乳鼠,它對柯薩基病毒、呼吸道病毒和蟲媒病毒感染有很高的易感性。
      選用實驗動物不僅考慮它的易感性,還考慮接種途徑,例單純皰疹病毒的易感動物為家兔、豚鼠,接種途徑分別是角膜、腦內和肉趾。
      常見病毒敏感動物的選擇:病毒易感動物的研究,一直是病毒學中的重要內容之一。實驗動物在人類病毒學發(fā)展史上起重要作用,主要用作分離病毒、抑制病毒的藥物篩選、疫苗效果及安全性鑒定、制備病毒診斷試劑等。
      1. 黃熱病毒: 靈長類動物都易感,最為敏感的動物是恒河猴, 另外可用中國猴(Macacus Sinicus)及斷尾猴(M.Speciosus Thibetanus)。小鼠對黃熱病毒也敏感, 在沒有經濟實力,使用靈長類時,可用小鼠。令人感興趣的是:純血清接種的小白鼠尚能存活,而以稀釋血清接種的小白鼠卻于較短時間死亡。這一奇特現象的理由,可能是由于病人體內血清抗體早期出現之故。應用純血清時,這些抗體中和了病毒的作用,而當應用稀釋血清時,抗體濃度不足,但病毒在稀釋后仍然具有活力。
      2. 乙腦病毒:乙腦病毒屬于披蓋病毒的B組蟲蝶病毒。實驗室內,乳鼠和成年小白鼠腦內接種后發(fā)生致死性腦炎,腹腔內接種后乳鼠發(fā)生致死性腦炎。恒河猴、食蟹猴和成年倉鼠腦內接種后發(fā)生致死性腦炎,但周圍途徑接種時只發(fā)生無癥狀的病毒血癥。豚鼠和兔腦內或周圍接種,蝙蝠、小雞、和蒼鷺周圍接種后都只發(fā)生無癥狀的病毒血癥。蝙蝠可保持感染,經過冬眠后重新發(fā)生病毒血癥。
      3. 淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV):本病毒屬沙粒病毒屬, 對小白鼠腦內接種尤為敏感,可供分離病毒用,對猴及豚鼠有致病力。應使用4周齡的小鼠及乳鼠、未斷乳豚鼠和200-400g重的豚鼠?赡軙r,采用“瑞士”Albinos種小鼠。飼養(yǎng)中, 應確保無LCM病毒感染。為取得最好效果,一方面接種幼年動物,另一方面用年齡較長的。接種量如下:
      6-8天齡乳鼠:腦內接種0.03ml,腹腔接種0.2ml。4周齡小鼠:腦內接種0.03ml ,腹腔接種0.25ml。未斷乳的小鼠:腦內接種0.05ml,腹腔接種1ml。已斷乳的200- 400g豚鼠腦內接種0.15ml,腹腔接種5ml。
      不同接種途徑的感受性亦不同。腦內接種感染而發(fā)病的鼠數(4周齡以上的) 遠比經腹腔內接種者為多。經腹腔接種者可不顯任何癥狀。豚鼠(250g以上)二種接種途徑的發(fā)病數大致相等(有時腦內接種稍高些),但這些資料并不對所有毒株適用。小白鼠感染后表現多樣,可能有三種情況:①急性疾病并死亡;②急性疾病,恢復并產生抗體;③形成持續(xù)感染,攜帶病毒,不產生抗體。
      產生急性疾病的動物一般在感染后4-7天出現體征,表現為弓背、豎毛、嗜睡、 眼炎、頭部水腫等。
      4. 脊髓灰質炎病毒:屬小核糖核酸(RNA) 病毒科、 腸道病毒屬的一種。 1908 年Landsteiner和Popper成功地把此病毒傳播于猴。在后來的40 年里證明了亞人類靈長類能經消化道感染。
      猴子:在此屬內猩猩能感染和人類完全相似的疾病。但此類動物不易常備。實際工作中,各種不同的獼猴對本病來說是猿類中最為優(yōu)良的品種,特別是Macacus Rhesus。長尾猴類以及狒狒類對脊髓灰質炎病毒亦有感受性,唯敏感性遠較獼猴為差。接種方法可用腹腔注射、坐骨神經附近的深部肌肉注射、鼻腔滴注。實際操作中最好以不同方法混合接種。
      嚙齒動物:病毒在應用嚙齒動物前,常需經猿類適應1-2代。嚙齒動物(棉鼠、小白鼠、田鼠、鼷鼠)可經腦內接種,最好選用年幼的動物、2-3周齡的小白鼠或15天齡的棉鼠。動物常于12-25天出現麻痹。
      5. 柯薩基(Coxsackie)病毒:屬小RNA病毒科腸道病毒屬。 根據本病毒對乳鼠的致病情況將其分成兩組。A組:產生彌漫性肌炎伴有隨意肌纖維的急性炎癥及壞死。B組:主要引起大腦局部退行性變化等。
      6. 流感病毒,屬于正粘液病毒屬。動物模型最好選用雪貂,也可用小白鼠、 金黃地鼠、豚鼠、猴及豬。
      7. 麻疹病毒:除靈長類外,一般動物均不易感。1911年首次成功的傳給獼猴。 以后證明,除了接種和吸入外,其它種類的猴,如:猿類、恒河猴、崇猴、爪哇猴、矮猴等,對各種不同接種途徑也易感染。其癥狀類似人類麻疹。潛伏期為3-22天,病毒血癥期為4-15天,約一半動物有皮疹、結膜炎、卡它和發(fā)熱。
      適應在組織培養(yǎng)上的病毒可在乳鼠或乳地鼠體內繁殖,腦內接種可引起腦膜炎癥狀。
      8. 呼吸道合胞病毒:猩猩感染后可產生與人一樣的上呼吸道臨床癥狀。 猴, 如Cebus猴感染本病毒后,可引起肺炎。在肺和支氣管都可以找到呼吸道合胞病毒抗原。Cobues猴感染后4-6天,病毒繁殖方可達到高峰,并出現臨床癥狀。
      地鼠和棉鼠對呼吸道合胞病毒較敏感,感染后,在其細支氣管及肺可以找到呼吸道合胞病毒。
      9. 狂犬病毒(Rabies Virus):1987年Galfiev首先用家兔作為實驗動物,進行了傳統(tǒng)的實驗,在該實驗中,巴德斯培育了對犬致病力減弱而對家兔具有固定潛伏期的毒株。實驗室感染實驗,常選用中國地鼠、小白鼠、豚鼠和兔(按敏感性程度排列)。
      顱內接種比皮下或肌肉注射更可靠。
      10. 天花病毒:猴及家兔均敏感。應選用雄兔作皮膚劃痕接種、角膜劃痕接種、睪丸內接種。猴子則在脅腹部皮膚上作劃痕,如系雄猴則同時作睪丸內接種。感染后兔皮膚劃痕處出現明顯的皮疹;角膜炎輕微或缺如,無睪丸炎;猴沿皮膚劃痕出現典型皮疹,如做睪丸內接種,則有睪丸炎發(fā)生。
      11. 單純皰疹病毒(HSV):家兔為最適宜的動物,豚鼠、小白鼠、地鼠也可用。 用家兔及豚鼠的原因之一,是因為可以用有菌材料做角膜接種而可不加抗菌素或過濾,不妨礙病毒生長。
      12. 水痘-病毒帶狀皰疹(VZV)、 巨細胞病毒:還未發(fā)現有實驗動物對這兩種病毒敏感。
      13. 甲型肝炎病毒(HAV):1976年Deinhardt等首次證明HAV可在絨猴體內增殖, 此后Mascoli等從絨猴體內發(fā)現人類HAVCR326株。絨猴、黑猩猩、紅面猴對HAV均易感,經口或靜脈注射接種病毒后,可產生肝炎。
      14. 乙型肝炎病毒(HBV):黑猩猩是HBV的易感動物,絨猴雖可感染但不如前者敏感。因此用黑猩猩研究HBV的發(fā)病機理、檢測自動免疫、被動免疫的效果以及HBV疫苗的安全性。
      目前為止,各種病毒敏感動物的研究,仍然是病毒學中引人矚目的領域,因為在不同病毒疾病發(fā)病機制的研究、抗病毒藥物篩選、疫苗效果及安全性鑒定等方面,動物模型都有其獨特的優(yōu)越性。但就病毒分離而言,使用組織培養(yǎng)的方法,對于某些病毒更為方便。不同實驗室可根據其實驗目的、動物來源情況等,選擇不同的敏感動物。
      (三)老年病研究中實驗動物的選擇
      隨著社會的發(fā)展、經濟衛(wèi)生狀況的改善和科學技術的日益進步,人類的平均壽命也越來越長,老年人在總人口中的比例不斷增加,因此老年病研究已成為生物醫(yī)學研究的重要課題。
      目前,用于老年醫(yī)學研究的實驗動物以哺乳類動物為主體,有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、豬、猴等,其中大鼠使用最多,并廣泛用于各種項目的研究,其中以細胞生化學、消化器、激素、酶等的研究為主。小鼠的使用率雖比大鼠低,但用途廣泛,以放射線、消化器、免疫、酶的研究為主。魚類、兩棲類、爬蟲類以及無脊椎動物等,絕大多數被用以比較生物學的研究。對各研究項目每年所使用的實驗動物種類進行調查,結果發(fā)現在DNA、染色體、放射性、細胞生物學、培養(yǎng)細胞、腦神經、循環(huán)器、呼吸器、腎臟、消化器、內分秘、運動器、皮膚、感覺器、結締組織、RNA等眾多項目中, 大鼠、小鼠的使用量最高;在糖質、脂質、膠原和免疫項目中,小鼠的使用率比大鼠高; 在比較生物學的研究中,所有的動物使用量差不多。
      非哺乳動物在老年醫(yī)學研究中也被選用,如果蠅、沙蚤、蚯蚓、輪蟲、水螅、原蟲等。天津醫(yī)學院老年實驗室推薦以果蠅做為老年學實驗動物模型較為適宜,果蠅的生存期短、繁殖快、高度純種、飼養(yǎng)管理簡便。
      (四)中醫(yī)中藥研究中實驗動物的選擇
      中醫(yī)中藥的研究由經驗進入了實驗研究階段,已建立了:“陽虛”、“陰虛”、“脾虛”、“脈微欲絕”、“血虛”、“血瘀”、“肝郁”、“寒證”、“熱證”、“溫病”及“里實”等11種動物實驗模型。其造型的思路和方法除個別者外,均是選擇一些造成與臨床證型相仿的致病因素,作用于動物機體使其產生類似臨床某些證的模型。
      中醫(yī)證型動物模型造型方法:
      1. “衛(wèi)氣營血”模型:選用家兔, 體重2.1~2.75kg。用強毒力的大腸桿菌以0.75ml(每ml含大腸桿菌27億)/kg體重,注射至兔耳緣靜脈造型。感染后動物表現圈縮、懶動、少食、體溫升高、心率增快、耳血管周圍滲血、出血;舌象有明顯病理改變;血培養(yǎng)有大腸桿菌生長,白細胞及血小板顯著減少?100%造型成功。
      2. “寒證、熱證”模型:選用雌性大鼠,體重170~210g。熱證型:用溫熱藥(附子、干姜、肉桂、黨參、黃芪、白術)制成100%水煎劑灌胃,每次2ml,每日2次。寒證型:首先于腹腔內注射三聯疫苗1ml,每日1次共2次;然后給予寒冷藥(膽草、黃連、黃柏、銀花、連翹、石膏)制成的100%水煎劑灌胃,每日2次,每次2ml。給藥后15天60-70 %造型成功。熱證型:心率加快,飲水量增多,尿內兒茶酚胺及17- 羧皮質類固醇排出量增多。寒證型:心率減慢,尿內兒茶酚胺及17-羧皮質類固醇排出量減少。 用此模型可測量痛閾和驚厥閾值及腦內介質;觀察動情周期及血內孕酮含量。
      3. “血瘀”模型:高粘滯血癥模型:選用家兔,耳緣靜脈注入10 %葡萄糖生理鹽水,每公斤體重注入5ml,可100%造型成功。給藥后可見微循環(huán)血流變慢,紅細胞聚集,全血及血漿粘度增加,血沉快,紅細胞電泳變慢。此模型適用于“活血化瘀”藥物作用原理的研究。
      4. “血虛”模型:選用雄性大鼠,體重180~250g。于實驗第1、4、7天皮下注射2%乙;诫(Acety-Phenyhydrazine,APH)生理鹽水溶液,以每100g 體重計, 第一次1ml,第2、3次0.5ml。給藥后可形成實驗性溶血性貧血。紅細胞與血紅蛋白減少,出現大量海氏(Heine)小體?删S持9~14天。此模型適用于血虛與氣虛藥物的研究。
      5. “脾虛”模型:選用雄性大鼠,以大黃、玄明粉、旋明粉水煎劑和大黃、番瀉液灌胃給藥,給藥后動物發(fā)生腹瀉、消瘦、食量下降、精神不振,毛發(fā)欠光澤,基本符合臨床脾虛病人癥狀。
      6. “肝郁”模型:選用大鼠和小鼠。小鼠腹腔注射艾葉注射液0.6ml(含生藥0.3g),每日1次,分別于45天及60天處死。大鼠腹腔注射艾葉注射液2ml(含生藥2.0g)每日1次,半月后改為隔日1次40天處死。艾葉中毒后動物易激怒,好斗,咬人,進食量少,體重增加慢。小鼠:肝臟有灶性壞死,以60天組較45天組為重。大鼠:肝細胞腫脹,胞漿疏松出現顆粒,門區(qū)有嗜酸性細胞浸潤,中央靜脈充血。

       

       

       
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