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1.染色 切片經(jīng)固定后,滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1:8或1:16的熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等),在室溫或37℃染色30min,切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi),防止干燥。
2.洗片 傾去存留的熒光抗體,將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次,攪拌,每次5min,再用蒸餾水洗1min,除去鹽結(jié)晶。
3.用50%緩沖(0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0~9.5)甘油封固、鏡檢
4.對(duì)照染色
①正常免熒光血清染色,如上法處理切片,結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗(yàn)(一步法):將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致,可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清,染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原染色試驗(yàn),前面已作敘述。
直接法比較簡(jiǎn)單,適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原,特異性高而敏感性較低。
。ǘ╅g接法
。1)切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的濕度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液體。
。2)再滴加間接熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等),同上步驟,染色30min,37℃,緩沖鹽水洗兩次10min,攪拌,緩沖甘油封固,鏡檢。
對(duì)照染色:①抗體對(duì)照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法進(jìn)行染色,結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對(duì)照:即類屬抗原染色,亦應(yīng)為陰性。③陽性對(duì)照。
間接法中上述方法稱雙層法(Double Layer Method)。另一種稱夾心法,即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合,再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上,而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在,方法步驟如下:
①切片或涂片固定后,置于染色濕盒內(nèi)。
、诘渭游礃(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃,30min。
、劬彌_鹽水洗2次,每次5min,吹干。
、艿渭犹禺愋詿晒饪贵w再用切片于37℃,30min。
、萑纰鬯础
⑥緩沖甘油封固,鏡檢。
間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原,敏感性較高,操作方法較易掌握,而且能解決一些不易制備動(dòng)物免疫血清的病原體(如麻疹)等的研究和檢查,所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的試驗(yàn)。
。ㄈ┭a(bǔ)體法
1.材料
。1)免疫血清60℃滅活20min,用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1:2,1:4,1:8……。補(bǔ)體用1:10稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補(bǔ)體熒光抗體等,按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià),如為1:32則免疫血清應(yīng)作1:8稀釋。
。2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1:10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果,按2單位的比例,用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中,溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。
(3)抗補(bǔ)體熒光抗體:在免疫血清效價(jià)為1:4,補(bǔ)體為2單位的條件下,用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià),然后按染色效價(jià)1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2.方法步驟
。1)涂片或切片固定。
。2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。
。3)用緩沖鹽水洗2次,攪拌,每次5min,吸干標(biāo)本周圍水液。
(4)滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min,37℃,水洗同(3)。
。5)蒸餾水洗1min,緩沖甘油封固。
3.對(duì)照染色
。1)抗原對(duì)照。
。2)抗血清對(duì)照:用正常兔血清代替免疫血清。
(3)滅活補(bǔ)體對(duì)照:將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后,按補(bǔ)體同樣比例稀釋,與免疫血清等量混合后,進(jìn)行補(bǔ)體法染色。
本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制,因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用,敏感性亦較間接法高,效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用,節(jié) 省免疫血清,尤其是對(duì)檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。
(四)膜抗原熒光抗體染色法
本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟,可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色,常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的檢查和研究,陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。FACS即采用此法原理。
。ㄎ澹╇p重染色法
在同一標(biāo)本上有兩個(gè)抗原需要同時(shí)顯示(如A抗原和B抗原),A抗原的抗體用FITC標(biāo)記,B抗原的抗體用羅達(dá)明標(biāo)記,可采用以下染色方法:
1.一步法雙染色 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合(A B),按直接法進(jìn)行染色。
2.二步法雙染色 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色,不必洗去,再用FITC標(biāo)記的A抗體染色,按間接法進(jìn)行。
結(jié)果:A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色,B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。
(六)熒光抗體再染色法
若切片或其他標(biāo)本經(jīng)某種熒光抗體染色后,未獲得陽性結(jié)果,而又疑有另外的病原體存在時(shí),可用相應(yīng)的熒光抗體再染色。
有時(shí)存檔蠟塊不能再用以切片,也可用存檔的HE染色標(biāo)本,褪去蓋片和顏色,再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。