1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。

　　2．洗片 　傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。

　　3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢

　　4．對照染色

　�、僬�常免熒光血清染色，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗(yàn)（一步法）：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原染色試驗(yàn)，前面已作敘述。

　　直接法比較簡單，適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。

　�。ǘ�）間接法

　�。�1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

　�。�2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

　　對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。③陽性對照。

　　間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在，方法步驟如下：

　�、偾衅�或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。

　�、诘渭游礃�(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

　�、劬彌_鹽水洗2次，每次5min，吹干。

　�、艿渭犹禺愋詿晒饪贵w再用切片于37℃，30min。

　�、萑纰鬯�洗。

　　⑥緩沖甘油封固，鏡檢。

　　間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的試驗(yàn)。

　�。ㄈ�）補(bǔ)體法

　　1．材料

　　（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。

　　（2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

　�。�3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

　　2．方法步驟

　�。�1）涂片或切片固定。

　�。�2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。

　　（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液。

　�。�4）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。

　�。�5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

　　3．對照染色

　�。�1）抗原對照。

　�。�2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。

　�。�3）滅活補(bǔ)體對照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。

　　本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié)　省免疫血清，尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。

　�。ㄋ模┠た乖瓱晒饪贵w染色法

　　本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。FACS即采用此法原理。

　�。ㄎ澹╇p重染色法

　　在同一標(biāo)本上有兩個(gè)抗原需要同時(shí)顯示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用羅達(dá)明標(biāo)記，可采用以下染色方法：

　　1．一步法雙染色　 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A B），按直接法進(jìn)行染色。

　　2．二步法雙染色 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。

　　結(jié)果：A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。

　�。�六）熒光抗體再染色法

　　若切片或其他標(biāo)本經(jīng)某種熒光抗體染色后，未獲得陽性結(jié)果，而又疑有另外的病原體存在時(shí)，可用相應(yīng)的熒光抗體再染色。

　　有時(shí)存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標(biāo)本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。