大分子導(dǎo)入細(xì)胞技術(shù)

外源核酸、多肽導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法繁多，大致可分為三類：化學(xué)方法、物理化學(xué)方法和生物學(xué)方法。化學(xué)方法常見的有磷酸鈣沉淀法、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和PEI介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法等；物理方法有電穿孔法，基因槍粒子轟擊法等；生物學(xué)方法中，目前主要是利用病毒作為外源核酸、多肽導(dǎo)入的工具，通過病毒感染將外源核酸、多肽導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)　 細(xì)胞顯微注射技術(shù)

[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯
1 了解細(xì)胞顯微注射的基本原理
2 掌握細(xì)胞顯微注射基本技術(shù)

[實(shí)驗(yàn)原理]
顯微注射技術(shù)是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受體細(xì)胞的基因組內(nèi)，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體動(dòng)物的子宮內(nèi)發(fā)育，從而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。它是目前基因轉(zhuǎn)移效率較好的一種基因轉(zhuǎn)移方法，可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移；外源基因的長度不受限制, 可達(dá)100kb ；實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)比較短。它的不足之處是：需要昂貴精密的設(shè)備；顯微注射操作復(fù)雜，需專門技術(shù)人員；導(dǎo)入外源基因整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)無法控制；常導(dǎo)致插入位點(diǎn)附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變，可造成動(dòng)物嚴(yán)重的生理缺陷。盡管如此，由于顯微注射技術(shù)直接對(duì)基因進(jìn)行操作，整合率較高，因而仍是目前建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物極為重要的方法。
顯微注射技術(shù)在植物、動(dòng)物的細(xì)胞發(fā)育研究的應(yīng)用，為研究體內(nèi)生理和體外的生化過程架起橋梁，將特定的分子探針及衍生的細(xì)胞間質(zhì)成分導(dǎo)入活體細(xì)胞，為研究控制細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制提供了新的視野。

[儀器、材料和試劑]
（一） 儀器和用具：
倒置顯微鏡（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）；
Leitz重型基座（用于安放顯微鏡和微操作儀）；
微操作儀：Leitz（手動(dòng)系統(tǒng)，安在平臺(tái)上）或Eppendorf 5171（自動(dòng)軸向微注射系統(tǒng)，可固定在顯微鏡的載物臺(tái)上）；
微注射器：Eppendorf 5242，也可選用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉針儀：水平拉針儀P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉針儀720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射針頭：可購買廠商拉制好的商品，也可用拉針儀自行拉制（可參照[方法與步驟]中的1.1注射針頭的拉制）。
細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、塑料平皿和蓋玻片等。
（二） 材料：
（三） 試劑：
緩沖培養(yǎng)基（含25mmol/L HEPES pH7.2）；注射緩沖液（10mmol/L H2PO4-和HPO42-，pH7.2，84mmol/L K ，17mmol/L Na ，1mmol/L EDTA）

[方法與步驟]
1． 材料準(zhǔn)備
1.1 注射針頭的拉制
水平拉針儀：裝上一根毛細(xì)管，擰緊左右兩側(cè)的夾子，做好固定，并使其中間部位對(duì)準(zhǔn)加熱絲。設(shè)定好電流、拉力和時(shí)間。然后按開始鍵，等待毛細(xì)管被拉成兩個(gè)所需的微注射針頭。
垂直拉針儀：把玻璃毛細(xì)管固定在上面的夾子上，使其對(duì)準(zhǔn)加熱絲后旋緊。抬起下面的滑夾，固定在毛細(xì)管上。調(diào)整熱度和螺線管范圍。
使用拉針儀自行拉制的微注射針頭，最好使用硼硅酸鹽玻璃的毛細(xì)管�？梢圆捎霉柰閷�(duì)注射針頭進(jìn)行處理，以防樣品和培養(yǎng)基成分與玻璃的親水表面相互作用，從而引起針尖阻塞而影響注射。
1.2 蓋玻片的處理
1 把蓋玻片放在陶瓷或金屬架上，相互不要接觸。
2 在裝有自來水的燒杯中，快速浸泡和沖洗。
3 在紙巾上把架子控干，再放入盛有0.1mol/L HCl的燒杯中，溫育過夜。
4 用自來水沖洗蓋玻片，每次10min，共5次。
5 把架子浸入70%的乙醇中，溫育60min。
6 用去離子水短暫沖洗，放在紙巾上控干。
7 在室溫下自然干燥30min。
8 在220～250℃烤6 h。
1.3 顯微注射用細(xì)胞的準(zhǔn)備
1 在注射前一天，把細(xì)胞鋪到直徑為10～15mm的蓋玻片上，每個(gè)蓋玻片250～1000個(gè)細(xì)胞。
2 在注射前，把帶有需要注射細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移至新的組織培養(yǎng)皿中，迅速用金剛石筆在蓋玻片上劃一個(gè)十字或一個(gè)圓圈標(biāo)記（金剛石筆使用前用70%乙醇沖洗，并在超凈臺(tái)中用火焰燒一下），然后加入3ml有緩沖液的培養(yǎng)基。

2．顯微注射操作過程
2.1　針頭裝液
1　使用無菌的微量加樣器從微注射針頭的后部加入0.5～1μl的注射樣品。
2　使用玻璃毛細(xì)管拉出毛細(xì)管針頭，里面有與毛細(xì)管平行的細(xì)絲，有利于液體從后部向針頭方向運(yùn)動(dòng)。只需在針頭后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他東西接觸，就足以使少量的樣品到達(dá)針尖部。
2.2　針頭定位
1　將裝液后的針頭的游離端安在連接器上，然后旋緊連接器以固定針頭，再將其固定到微操作儀的托針管上。
2　把載有待注射細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移到里面有緩沖培養(yǎng)基的平皿中，將其放在中央。
3　將培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺(tái)上，盡量將蓋玻片上所畫圓圈的一個(gè)對(duì)準(zhǔn)光照的中心區(qū)，這時(shí)光的亮度最好。
4　用低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞調(diào)焦。
5　將針頭推入視野中心，在視野中針頭呈陰影狀。
6　輕輕的落下針頭，直至到達(dá)培養(yǎng)基中后停下。
7　通過顯微鏡觀察，移動(dòng)針頭，必要時(shí)調(diào)整微操作儀，直到針頭的陰影在視野的上方。然后確定針頭的位置，使其約處在視野中心。
8　輕輕下調(diào)針頭，直到針頭變得清晰一些
2． 調(diào)到工作放大倍數(shù)，調(diào)準(zhǔn)細(xì)胞焦距，找到針尖。
3． 如果找不到，重新使用低倍鏡，盡量將針頭調(diào)到視野的中心，重復(fù)上述的步驟。
10　小心下調(diào)針尖，直到其完全聚焦。
1.3 顯微注射的操作
2.3.1　手動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)注射
1 使用最低放大倍數(shù)（50×），把焦距對(duì)準(zhǔn)位于蓋玻片上注射標(biāo)記區(qū)域的細(xì)胞平面上。用肉眼將注射針頭對(duì)準(zhǔn)到照度最亮處的中心，降下針頭，直到進(jìn)入培養(yǎng)基。把針頭調(diào)入到視野的中心，輕輕放下針頭，直到看清楚為止。然后將放大倍數(shù)調(diào)至工作倍數(shù)，即320×，對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞表面調(diào)焦。將針頭調(diào)整到中心，下降針頭，對(duì)準(zhǔn)焦距。移動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)，使針尖對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞核或核周的胞質(zhì)。
2 小心落下針尖，使其進(jìn)入細(xì)胞核或核周的胞質(zhì)。
3 使用注射器施加注射壓
4 輕輕上提針頭，直到離開細(xì)胞。
5 移動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)，找到下一個(gè)細(xì)胞，重復(fù)2～4步驟。
2.3.2 自動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)注射和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射
1 按上述手動(dòng)系統(tǒng)的方法將針頭調(diào)整至視野中間，不同的是通過控制面板自動(dòng)控制微操作部分。
2 工作放大倍數(shù)為320×，下降針頭，使之觸及細(xì)胞核或核周間隙上方的細(xì)胞表面，直到細(xì)胞表面見到一個(gè)輕微的壓跡。
3 通過控制部分，設(shè)定細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射的定位參數(shù)。
4 將針頭略提起，離開細(xì)胞表面幾微米，選擇一個(gè)新細(xì)胞，按下操縱桿上方的按鈕進(jìn)行微注射。針頭首先在水平面上做逆向軌跡運(yùn)動(dòng)，然后朝向細(xì)胞做出一個(gè)迅速的軸向運(yùn)動(dòng)，正好刺入細(xì)胞內(nèi)預(yù)先設(shè)定好的坐標(biāo)位置，這時(shí)微操作儀的控制部分，激活注射壓力，持續(xù)時(shí)間已經(jīng)預(yù)先設(shè)定好。針頭回到原來的位置。
5 在必要的情況下，可以在控制面板上修正各種參數(shù)，因?yàn)樯w玻片和平皿的表面不是十分平整，所以當(dāng)從蓋玻片的一個(gè)地方移動(dòng)到另一個(gè)地方進(jìn)行注射時(shí)，一定要重新調(diào)整細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)的坐標(biāo)。

3　對(duì)注射了熒光標(biāo)記物的細(xì)胞的分析
熒光標(biāo)記物，如FITC-葡聚糖等常用來作注射用標(biāo)記物，以分辨出已經(jīng)注射的細(xì)胞。濃度為0.25%～1%時(shí)，這種物質(zhì)的毒性很小，而且在細(xì)胞增殖的2～4天仍可見。
3.1 在PBS中輕輕沖洗注射過的細(xì)胞兩次。
3.2 用甲醇（2min）或PFA/GA（5min）快速固定
3.3 用去離子水快速?zèng)_洗蓋玻片。
3.4 滴一滴Mowiol，將蓋玻片裝到載玻片上。

[注意事項(xiàng)]
1 在整個(gè)過程中，注射針尖應(yīng)遠(yuǎn)離人員和實(shí)驗(yàn)室中的儀器。注射針在持針器上安裝不牢時(shí)，注射器、管子及注射針內(nèi)的壓力，可能將注射針射出。
2 在反向充填液體時(shí)，適當(dāng)?shù)卦陲@微鏡下觀察注射針尖，以決定在加壓時(shí)是否注射針阻塞或偏斜。阻塞通�？赏ㄟ^將針尖輕輕敲擊一個(gè)固定物而得以緩解。針尖偏斜的注射針是適合于顯微注射的，但其使用應(yīng)做細(xì)微調(diào)整或補(bǔ)償注射中加壓所造成的額外偏斜。
3 注射速度過快能擾亂細(xì)胞質(zhì)成分，細(xì)胞裂解或細(xì)胞從底層移位。當(dāng)注射體積小于估計(jì)的細(xì)胞體積的50%，并且注射樣品的流動(dòng)速度幾乎不導(dǎo)致可見的細(xì)胞質(zhì)移位時(shí)，注射效果最好。
4 用紫外光可看到注入標(biāo)記物后的活細(xì)胞，但會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可恢復(fù)的損傷，因此應(yīng)盡可能縮短紫外光照射時(shí)間。
5 如果對(duì)已經(jīng)注射的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光測(cè)定或其他處理，最好使用可固定的葡聚糖，以防在沖洗中造成標(biāo)記物的擴(kuò)散損失。

磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯
1 了解細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理和基本方法
2 磷酸鈣沉淀法的基本技術(shù)要點(diǎn)

[實(shí)驗(yàn)原理]
磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的一種將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，磷酸鈣被認(rèn)為有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以整合到靶細(xì)胞的染色體中從而產(chǎn)生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成�？蓮V泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細(xì)胞，不但適用于短暫表達(dá)，也可生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

[儀器、材料和試劑]
1　呈指數(shù)生長的真核細(xì)胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纖維細(xì)胞）
2　完全培養(yǎng)液（依所用的細(xì)胞系而定）
3　CsCl純化的質(zhì)粒DNA （10～50μg/次轉(zhuǎn)染，二次純化）
4　2×HEPES緩沖鹽水(HeBS)
(pH6.95～7.05)　50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調(diào)pH至6.95～7.05,過濾除菌后,-20℃保存?zhèn)溆谩?br />5　2.5mol/L CaCl2過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?br />6　磷酸緩沖鹽水（PBS）
7　37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱
8　100mm組織培養(yǎng)平板
9　15ml錐形管

[方法與步驟]
1　傳代細(xì)胞準(zhǔn)備　細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24ｈ傳代,待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%滿底時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。
2　DNA沉淀液的準(zhǔn)備　首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。
3 用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時(shí)用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個(gè)過程需緩慢進(jìn)行，至少需持續(xù)1～2min。
4 室溫靜置30min,出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀。
5 將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動(dòng)。
6 在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下培養(yǎng)細(xì)胞4～16h。除去培養(yǎng)液，用5ml　1×HeBS洗細(xì)胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。
7 收集細(xì)胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。

[注意事項(xiàng)]
1 在整個(gè)轉(zhuǎn)染過程中都應(yīng)無菌操作。
2 為獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DNA應(yīng)不含蛋白質(zhì)和酚。乙醇沉淀后的DNA應(yīng)保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解。
3 沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時(shí)需用空氣吹打，以確保形成盡可能細(xì)小的沉淀物，因?yàn)槌蓤F(tuán)的DNA不能有效地粘附和進(jìn)入細(xì)胞。
4 在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗�離最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都可能導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。

電穿孔和電融合技術(shù)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />1．了解細(xì)胞電穿孔和電融合的基本原理
2．學(xué)習(xí)電穿孔和電融合基本技術(shù)

【實(shí)驗(yàn)原理】
當(dāng)細(xì)胞置于非常高的電場(chǎng)中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。運(yùn)用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細(xì)胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，電穿孔已被廣泛用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細(xì)胞。與其他常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，不必象顯微注射那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對(duì)成百萬的細(xì)胞進(jìn)行注射。第二，與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學(xué)副作用。第三，因?yàn)殡姶┛资且环N物理方法，較少依賴細(xì)胞類型，因而應(yīng)用廣泛。實(shí)際上，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。
除了能使細(xì)胞膜具有通透性，讓外界的分子擴(kuò)散入胞液中以外，高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖也能引起細(xì)胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細(xì)胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細(xì)胞相互融合制備動(dòng)物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已證明使用電場(chǎng)電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到100倍，最近，貼壁細(xì)胞的電融合還被用來研究細(xì)胞融合時(shí)細(xì)胞的骨架成分和細(xì)胞器的動(dòng)力學(xué)重排。

【儀器、材料和試劑】
儀器：脈沖發(fā)生器；樣品池（一個(gè)盛細(xì)胞的容器和兩個(gè)平行的金屬電極）；CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡；離心機(jī)，微量移液器，鑷子，剪刀，手術(shù)刀片，三角瓶，吸管，毛細(xì)管，離心管，載玻片，蓋玻片，NALGEN一次性濾器。
材料：外源DNA，對(duì)數(shù)生長中期細(xì)胞
試劑：
穿孔介質(zhì)（PM）：磷酸鉀 15mmol/L
MgCl2 　1mmol/L
蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　
HEPES 10mmol/L　調(diào)節(jié)pH至7.3
融合介質(zhì)（FM）：MgCl2 1mmol/L
甘露醇 280mmol/L
HEPES 　2mmol/L　調(diào)節(jié)pH至7.3

【方法與步驟】
懸浮細(xì)胞的電穿孔法：
1．電穿孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移
電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細(xì)胞中，操作步驟相似。本實(shí)驗(yàn)中，我們以基因轉(zhuǎn)移為例。載入其他的分子時(shí)，只需把外源DNA換成所需分子即可。
1.1　使細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，用胰酶處理，收獲對(duì)數(shù)生長中期的細(xì)胞，并用腺酶處理。
1.2　在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細(xì)胞時(shí)，在臺(tái)式離心機(jī)上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細(xì)胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細(xì)胞。
1.3　計(jì)數(shù)細(xì)胞，在PM中，濃縮細(xì)胞為大約1千萬細(xì)胞/ml。
1.4　將DNA加到細(xì)胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細(xì)胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
1.5　在電穿孔裝置上設(shè)置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時(shí)間常數(shù)，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設(shè)備是CD脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電阻，以達(dá)到合適的τ值。
1.6　將小池放進(jìn)盛樣品的池中，啟動(dòng)電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。
1.7　電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細(xì)胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。
1.8　在測(cè)定轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)量前電穿孔細(xì)胞各自培養(yǎng)的時(shí)間不同。
2．檢測(cè)電穿孔效率和細(xì)胞存活率
2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標(biāo)細(xì)胞的方法如前所述。
2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
2.3 電穿孔后30min，向細(xì)胞懸液中加30μl臺(tái)盼藍(lán)，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。
2.4 在1000rpm下離心3min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于PM中，終體積100μl。
2.5 將一滴細(xì)胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞，測(cè)定攝取熒光標(biāo)記葡聚糖的百分?jǐn)?shù)。
2.6 在亮視野鏡片下，死細(xì)胞可因染成藍(lán)色檢測(cè)出（攝取了臺(tái)盼藍(lán)），測(cè)定細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。
2.7 在各種電場(chǎng)設(shè)定值下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，畫出攝取葡聚糖率和細(xì)胞存活率對(duì)電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對(duì)特定細(xì)胞類型電穿孔的最優(yōu)條件。

懸浮生長細(xì)胞的電融合
融合懸浮細(xì)胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進(jìn)行高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖前后，必須用低幅、高頻電場(chǎng)使細(xì)胞排成一條鏈。
1．用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細(xì)胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細(xì)胞時(shí)，在臺(tái)式離心機(jī)上1000rpm下離心3分鐘，得到細(xì)胞沉淀，棄去上清液將細(xì)胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。
2．將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細(xì)胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分混合。
3．啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞是否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達(dá)到最佳效果。
4．讓介電電泳場(chǎng)開約1分鐘后關(guān)掉，立即應(yīng)用融合脈沖，其振幅數(shù)量級(jí)為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進(jìn)行融合脈沖后立即再次啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，常規(guī)讓其開啟約2分鐘。
5．關(guān)掉介電電泳場(chǎng)，讓細(xì)胞在樣品池中靜置10分鐘。
6．去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細(xì)胞。
7．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

【注 意 事 項(xiàng)】
1．最優(yōu)組分依使用的特定細(xì)胞種類而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意，就應(yīng)嘗試改變穿孔介質(zhì)。
2．影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，為達(dá)到最高效率，必須收集對(duì)數(shù)生長中期的細(xì)胞。