一、體內(nèi)、外細胞的差異和分化
1、差異:細胞離體后,失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的相互影響,生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中,日久天長,易發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象減弱;形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡;或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此,培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體,它們既保持著與體內(nèi)細胞相同的基本結構和功能,也有一些不同于體內(nèi)細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,這種差異就開始發(fā)生了。
雖然體外細胞與機體細胞存有差異,但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內(nèi)相同(如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動),只從細胞遺傳學(Cyto-genetics)的角度看,離體細胞仍帶有全套的二倍體基因。細胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn),只不過是相應基因關閉/開啟引起的現(xiàn)象,這并非是絕對缺陷。恰恰相反,在培養(yǎng)的細胞中某些特定功能的喪失,可為該基因的表達與調(diào)控提供線索。
2、分化;體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失,只是環(huán)境的政變,細胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細胞是否表現(xiàn)分化關鍵在于是否存在使細胞分化的條件,如Friend細胞(小鼠紅白血病細胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內(nèi)皮細胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結構,雜交瘤細胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體,這些均屬于細胞分化行為。
二、體外培養(yǎng)細胞的分型
(一)貼附型:大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長,屬于貼壁依賴性細胞,判斷細胞形態(tài)時不能接體內(nèi)組織學標推判定,僅大致分成以下四型:
1、成纖維細胞型:胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外,凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外,凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。
2、上皮型細胞:細胞呈扁平不規(guī)則多角形,中央有圓形核,細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動,處于膜邊緣的細胞總與膜相連,很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細胞型:呈散在生長,一般不連成片,胞質(zhì)常突起,呈活躍游走或變形運動,方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定,有時難以和其他細胞相區(qū)別。
4、多型細胞型:有一些細胞,如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài),可統(tǒng)歸于此類。
(二)懸浮型;見于少數(shù)特殊的細胞,如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程
體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后,則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液,否則將影響細胞的繼續(xù)生存,這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,很多細胞特別是正常細胞,在體外的生存也不是無限的,存在著一個發(fā)展過程。所有這一切,使組織細胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。
(一)培養(yǎng)細胞生命期(Life Span of Culture Cells)
所謂培養(yǎng)細胞生命期,是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細胞在培養(yǎng)中生命期如何?這要看細胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng),在不凍存和反復傳代條件下,可傳30~50代,相當于150~300個細胞增殖周期,能維待一年左右的生存時間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個體,則生存時間較短;如培養(yǎng)的為其它細胞如肝細胞或腎細胞,生存時間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時,細胞的生存期才可能發(fā)生改變。對此以后將詳述。
正常細胞培養(yǎng)時,不論細胞的種類和供體的年齡如何,在細胞全生存過程中,大致都經(jīng)歷以下三個階段:
1.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期:
也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動,可見細胞分裂,但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous),也即各細胞的遺傳性狀互不相同,細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時,細胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即細胞獨立生存性差?寺⌒纬陕始醇毎罕幌♂尫稚⒊蓡蝹細胞進行培養(yǎng)時,形成細胞小群(克。┑陌俜謹(shù)。初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型;由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大,是檢測藥物很好的實驗對象。
2.傳代期:
初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下,細胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細胞性質(zhì),細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存,則需反復傳代以維持細胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當傳代10~50次左右,細胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細胞進入第三期。
3.衰退期:
此期細胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細胞形態(tài)輪廓增強,最后衰退凋亡。在細胞生命期階段,少數(shù)情況下,在以上三期任何一點(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細胞永生性也稱不死性,即細胞獲持久性增殖能力,這樣的細胞群體稱無限細胞系(Infinite Cell Line),也稱連續(xù)細胞系(Continuous Cell Line)。在早期文獻中無限細胞系也稱已建立細胞系(Established Cell Line),現(xiàn)已不用。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,或第三期初階段。細胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā),轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養(yǎng)細胞一代生存期
所有體外培養(yǎng)細胞,包括初代培養(yǎng)及各種細胞系,當生長達到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞數(shù)量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數(shù)量大、細胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快(實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快)。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增殖快,培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
所謂細胞“一代”一詞,系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法,它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞,即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細胞一代中,細胞能倍增3~6次。細胞傳一代后,一般要經(jīng)過以下三個階段:
1.潛伏期(Latent Phase):
細胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同,這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞貼附慢,可長達10~24小時或更多;連續(xù)細胞系和惡性細胞系快,10~30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,它們有的存在于細胞膜的表面(如 CSP),有的則來自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。
細胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細胞,還要經(jīng)過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長,約24~96小時或更長,連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅6~24小時;細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時,標志細胞已進入指數(shù)增生期。
2.指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase):
這是細胞增值最旺盛的階段,細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%~0.5%,初代細胞分裂指數(shù)低,連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%~5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細胞一代中活力最好的時期,因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天后,隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細胞,由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(Piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營養(yǎng)充分,細胞仍然能夠進行增殖分裂,因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時,細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,不應混淆。
3.停滯期(Stagnate Phase):
細胞數(shù)量達飽和密度后,細胞遂停止增殖,進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細胞會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下,雖進行了傳代,因細胞已受損,需要恢復,至少還要再傳1~2兩代,通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后,才能再用。結果反而耽誤了時間,這是在實驗中應特別注意的。
1、差異:細胞離體后,失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的相互影響,生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中,日久天長,易發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象減弱;形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡;或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此,培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體,它們既保持著與體內(nèi)細胞相同的基本結構和功能,也有一些不同于體內(nèi)細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,這種差異就開始發(fā)生了。
雖然體外細胞與機體細胞存有差異,但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內(nèi)相同(如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動),只從細胞遺傳學(Cyto-genetics)的角度看,離體細胞仍帶有全套的二倍體基因。細胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn),只不過是相應基因關閉/開啟引起的現(xiàn)象,這并非是絕對缺陷。恰恰相反,在培養(yǎng)的細胞中某些特定功能的喪失,可為該基因的表達與調(diào)控提供線索。
2、分化;體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失,只是環(huán)境的政變,細胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細胞是否表現(xiàn)分化關鍵在于是否存在使細胞分化的條件,如Friend細胞(小鼠紅白血病細胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內(nèi)皮細胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結構,雜交瘤細胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體,這些均屬于細胞分化行為。
二、體外培養(yǎng)細胞的分型
(一)貼附型:大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長,屬于貼壁依賴性細胞,判斷細胞形態(tài)時不能接體內(nèi)組織學標推判定,僅大致分成以下四型:
1、成纖維細胞型:胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外,凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外,凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。
2、上皮型細胞:細胞呈扁平不規(guī)則多角形,中央有圓形核,細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動,處于膜邊緣的細胞總與膜相連,很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細胞型:呈散在生長,一般不連成片,胞質(zhì)常突起,呈活躍游走或變形運動,方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定,有時難以和其他細胞相區(qū)別。
4、多型細胞型:有一些細胞,如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài),可統(tǒng)歸于此類。
(二)懸浮型;見于少數(shù)特殊的細胞,如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程
體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后,則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液,否則將影響細胞的繼續(xù)生存,這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,很多細胞特別是正常細胞,在體外的生存也不是無限的,存在著一個發(fā)展過程。所有這一切,使組織細胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。
(一)培養(yǎng)細胞生命期(Life Span of Culture Cells)
所謂培養(yǎng)細胞生命期,是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細胞在培養(yǎng)中生命期如何?這要看細胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng),在不凍存和反復傳代條件下,可傳30~50代,相當于150~300個細胞增殖周期,能維待一年左右的生存時間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個體,則生存時間較短;如培養(yǎng)的為其它細胞如肝細胞或腎細胞,生存時間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時,細胞的生存期才可能發(fā)生改變。對此以后將詳述。
正常細胞培養(yǎng)時,不論細胞的種類和供體的年齡如何,在細胞全生存過程中,大致都經(jīng)歷以下三個階段:
1.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期:
也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動,可見細胞分裂,但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous),也即各細胞的遺傳性狀互不相同,細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時,細胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即細胞獨立生存性差?寺⌒纬陕始醇毎罕幌♂尫稚⒊蓡蝹細胞進行培養(yǎng)時,形成細胞小群(克。┑陌俜謹(shù)。初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型;由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大,是檢測藥物很好的實驗對象。
2.傳代期:
初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下,細胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細胞性質(zhì),細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存,則需反復傳代以維持細胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當傳代10~50次左右,細胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細胞進入第三期。
3.衰退期:
此期細胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細胞形態(tài)輪廓增強,最后衰退凋亡。在細胞生命期階段,少數(shù)情況下,在以上三期任何一點(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細胞永生性也稱不死性,即細胞獲持久性增殖能力,這樣的細胞群體稱無限細胞系(Infinite Cell Line),也稱連續(xù)細胞系(Continuous Cell Line)。在早期文獻中無限細胞系也稱已建立細胞系(Established Cell Line),現(xiàn)已不用。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,或第三期初階段。細胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā),轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養(yǎng)細胞一代生存期
所有體外培養(yǎng)細胞,包括初代培養(yǎng)及各種細胞系,當生長達到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞數(shù)量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數(shù)量大、細胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快(實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快)。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增殖快,培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
所謂細胞“一代”一詞,系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法,它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞,即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細胞一代中,細胞能倍增3~6次。細胞傳一代后,一般要經(jīng)過以下三個階段:
1.潛伏期(Latent Phase):
細胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同,這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞貼附慢,可長達10~24小時或更多;連續(xù)細胞系和惡性細胞系快,10~30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,它們有的存在于細胞膜的表面(如 CSP),有的則來自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。
細胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細胞,還要經(jīng)過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長,約24~96小時或更長,連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅6~24小時;細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時,標志細胞已進入指數(shù)增生期。
2.指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase):
這是細胞增值最旺盛的階段,細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%~0.5%,初代細胞分裂指數(shù)低,連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%~5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細胞一代中活力最好的時期,因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天后,隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細胞,由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(Piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營養(yǎng)充分,細胞仍然能夠進行增殖分裂,因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時,細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,不應混淆。
3.停滯期(Stagnate Phase):
細胞數(shù)量達飽和密度后,細胞遂停止增殖,進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細胞會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下,雖進行了傳代,因細胞已受損,需要恢復,至少還要再傳1~2兩代,通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后,才能再用。結果反而耽誤了時間,這是在實驗中應特別注意的。