【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />1．了解細(xì)胞電穿孔和電融合的基本原理
2．學(xué)習(xí)電穿孔和電融合基本技術(shù)

【實(shí)驗(yàn)原理】
當(dāng)細(xì)胞置于非常高的電場(chǎng)中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。運(yùn)用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細(xì)胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，電穿孔已被廣泛用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細(xì)胞。與其他常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，不必象顯微注射那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對(duì)成百萬(wàn)的細(xì)胞進(jìn)行注射。第二，與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒(méi)有生物或化學(xué)副作用。第三，因?yàn)殡姶┛资且环N物理方法，較少依賴細(xì)胞類型，因而應(yīng)用廣泛。實(shí)際上，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。
除了能使細(xì)胞膜具有通透性，讓外界的分子擴(kuò)散入胞液中以外，高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖也能引起細(xì)胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細(xì)胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細(xì)胞相互融合制備動(dòng)物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已證明使用電場(chǎng)電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到100倍，最近，貼壁細(xì)胞的電融合還被用來(lái)研究細(xì)胞融合時(shí)細(xì)胞的骨架成分和細(xì)胞器的動(dòng)力學(xué)重排。

【儀器、材料和試劑】
儀器：脈沖發(fā)生器；樣品池（一個(gè)盛細(xì)胞的容器和兩個(gè)平行的金屬電極）；CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡；離心機(jī)，微量移液器，鑷子，剪刀，手術(shù)刀片，三角瓶，吸管，毛細(xì)管，離心管，載玻片，蓋玻片，NALGEN一次性濾器。
材料：外源DNA，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期細(xì)胞
試劑：
穿孔介質(zhì)（PM）：磷酸鉀 15mmol/L
MgCl2 　1mmol/L
蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　
HEPES 10mmol/L　調(diào)節(jié)pH至7.3
融合介質(zhì)（FM）：MgCl2 1mmol/L
甘露醇 280mmol/L
HEPES 　2mmol/L　調(diào)節(jié)pH至7.3

【方法與步驟】
懸浮細(xì)胞的電穿孔法：
1．電穿孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移
電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細(xì)胞中，操作步驟相似。本實(shí)驗(yàn)中，我們以基因轉(zhuǎn)移為例。載入其他的分子時(shí)，只需把外源DNA換成所需分子即可。
1.1　使細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，用胰酶處理，收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞，并用腺酶處理。
1.2　在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細(xì)胞時(shí)，在臺(tái)式離心機(jī)上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細(xì)胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細(xì)胞。
1.3　計(jì)數(shù)細(xì)胞，在PM中，濃縮細(xì)胞為大約1千萬(wàn)細(xì)胞/ml。
1.4　將DNA加到細(xì)胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細(xì)胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
1.5　在電穿孔裝置上設(shè)置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時(shí)間常數(shù)，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設(shè)備是CD脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電阻，以達(dá)到合適的τ值。
1.6　將小池放進(jìn)盛樣品的池中，啟動(dòng)電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。
1.7　電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細(xì)胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長(zhǎng)。
1.8　在測(cè)定轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)量前電穿孔細(xì)胞各自培養(yǎng)的時(shí)間不同。
2．檢測(cè)電穿孔效率和細(xì)胞存活率
2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標(biāo)細(xì)胞的方法如前所述。
2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
2.3 電穿孔后30min，向細(xì)胞懸液中加30μl臺(tái)盼藍(lán)，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。
2.4 在1000rpm下離心3min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于PM中，終體積100μl。
2.5 將一滴細(xì)胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞，測(cè)定攝取熒光標(biāo)記葡聚糖的百分?jǐn)?shù)。
2.6 在亮視野鏡片下，死細(xì)胞可因染成藍(lán)色檢測(cè)出（攝取了臺(tái)盼藍(lán)），測(cè)定細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。
2.7 在各種電場(chǎng)設(shè)定值下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，畫(huà)出攝取葡聚糖率和細(xì)胞存活率對(duì)電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對(duì)特定細(xì)胞類型電穿孔的最優(yōu)條件。

懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的電融合
融合懸浮細(xì)胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進(jìn)行高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖前后，必須用低幅、高頻電場(chǎng)使細(xì)胞排成一條鏈。
1．用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細(xì)胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細(xì)胞時(shí)，在臺(tái)式離心機(jī)上1000rpm下離心3分鐘，得到細(xì)胞沉淀，棄去上清液將細(xì)胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。
2．將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細(xì)胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分混合。
3．啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞是否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達(dá)到最佳效果。
4．讓介電電泳場(chǎng)開(kāi)約1分鐘后關(guān)掉，立即應(yīng)用融合脈沖，其振幅數(shù)量級(jí)為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進(jìn)行融合脈沖后立即再次啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，常規(guī)讓其開(kāi)啟約2分鐘。
5．關(guān)掉介電電泳場(chǎng)，讓細(xì)胞在樣品池中靜置10分鐘。
6．去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細(xì)胞。
7．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

【注 意 事 項(xiàng)】
1．最優(yōu)組分依使用的特定細(xì)胞種類而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意，就應(yīng)嘗試改變穿孔介質(zhì)。
2．影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，為達(dá)到最高效率，必須收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)
1．黃培堂等譯　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南　北京:科學(xué)出版社,2001,793-800
2．汪和睦等　　細(xì)胞電穿孔電融合電刺激原理技術(shù)及應(yīng)用　天津科學(xué)技術(shù)出版社,2000,183-235